Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

74 A. Fluoreszenzeigenschaften von GFP Polyproteinen
Abbildung A.2: Typische Fluoreszenzbilder von längensortierten eGFP Polyproteinen. a) Monomere
b) Dimere c) Tetramere d) Nonamere e) 16-mere f) Unbekannte Länge
die doppelte Höhe wie Peaks in Bild a), während Peaks in Bild c) wiederum in etwa die
doppelte Höhe wie Peaks in Bild b) haben. Aufbauend auf der Monomerfraktion kann nun
Schritt für Schritt anhand des Fluoreszenzsignales auf die Länge der eGFP Polyproteine
zurückgeschlossen werden. Dazu muss sichergestellt werden, das mit dem aufgebauten
Instrument die Fluoreszenz einzelner eGFP Moleküle detektiert werden kann 1 . Dies kann
durch eine Untersuchung des Fluoreszenz-Zeitverhaltens einzelner Leuchtpunkte in einer
monomeren eGFP Lösung erfolgen.
Abb. A.3 zeigt das Fluoreszenz-Zeitverhalten einzelner, Zweifach-Cystein mutierter
eGFP Moleküle. Das Fluoreszenz-Zeitverhalten wurde durch die Aufnahme von Bildserien
(bis zu mehreren tausend Einzelbildern) im Abstand von 28.5 ms und bei einer Belichtungszeit
von 25 ms gewonnen. Die Fluoreszenz eines einzelnen Moleküls führt zu einem
beugungsbegrenzten Leuchtpunkt, der eine etwa 6x6 Pixel grossen Fläche auf dem Chip
der verwendeten EM-CCD Kamera ausleuchtet. Die Intensitäten der ausgeleuchteten Pixel
wurden für jedes aufgenommene Fluoreszenzbild gemittelt. Abb. A.3 a) zeigt typische
Fluoreszenz-Zeitkurven für einzelne eGFP Moleküle, bei denen die Aminosäuren 3 und
132 durch Cysteine ersetzt wurden, während Abb. A.3 b) Fluoreszenzsignale von einzelnen
(132, 212)-Cystein mutierten eGFP Molekülen zeigt.
1 Bei den Peaks in Abb. A.2 könnte es sich in jedem Fall um Aggregate einzelner Moleküle verschiedener
Größe handeln.