Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

A.3 Reduktion einzelner GFP Polyproteine zu Monomeren 77
Abbildung A.5: a) Mittleres Fluoreszenz-Zeitverhalten einzelner eGFP Polyproteine verschiedener
Länge. b) Initiale Fluoreszenzintensität relativ zur Monomerintensität als Funktion der
chromatographischen bestimmten Polyproteinlänge.
ebenfalls zunimmt. Darüberhinaus ist ein exponentieller Abfall der mittleren Fluoreszenz-
Intensität zu beobachten, der in allen Fraktionen vergleichbar schnell erfolgt. Die Abklingzeit
ist dabei durch die mittlere Zeit bis zum irreversiblen Bleichen einzelner eGFP
Moleküle bestimmt und konsistent mit der Literatur [83]. Für Abb. A.5 b) ist die mittlere
initiale Fluoreszenz-Intensität einzelner Polyproteine im Verhältnis zur Intensität von
eGFP Monomeren aus den verschiedenen Längenfraktionen über die chromatographisch
bestimmte Polyproteinlänge aufgetragen. Es ergibt sich eine Winkelhalbierende. Demnach
stimmt die anhand der Fluoreszenz einzelner Moleküle bestimmte Länge mit der über
Größenausschluss-Chromatographie bestimmten Länge überein. Das bedeutet, alle GFP
Untereinheiten in GFP Polyproteinen sind vollständig funktional und korrekt gefaltet.
A.3 Reduktion einzelner GFP Polyproteine zu Monomeren
Die Fluoreszenzerscheinung des GFP ermöglicht es zudem, die spezifische Verknüpfung der
GFP Polyproteine über kovalente Schwefelbrücken zwischen den eingeführten Cysteinen
direkt auf der Einzelmolekülebene nachzuweisen. Abb. A.6 a) zeigt ein typisches Fluoreszenzbild
von einzelnen Oberflächen-immobilisierten eGFP Polyproteinen aus einer 3000
Einzelbilder umfassenden Bildserie. Die Einzelbilder sind im Abstand von 28.5 ms bei einer
Belichtungszeit von 25 ms aufgenommen worden. Rotiert man diesen Bilderstapel um 90 ◦
um die Hochachse, so ergibt sich die Darstellung in Abb. A.6b). Eine vertikale Linie der
Darstellung in Abb. A.6 b) ergibt sich durch Kollaps sämtlicher Intensitätsinformationen
eines Einzelbildes aus der xy-Ebene auf die x-Achse. Die Aneinanderreihung der auf Linien
kollabierten Einzelbilder ermöglicht, die Dynamik der Fluoreszenzsignale in Form von