Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

A.2 Fluoreszenz einzelner GFP Polyproteine verschiedener Länge 73
rekt gefalteten und funktionalen GFP Molekülen führen, deren Raumstruktur vollständig
mit der des nativen GFP übereinstimmt. Der Polymerisationszustand einer GFP Polyproteinlösung
hat dabei keinen Einfluss auf die spektralen Eigenschaften der Proteinlösung.
A.2 Fluoreszenz einzelner GFP Polyproteine verschiedener
Länge
Das GFP bietet aufgrund seiner Fluoreszenz die Möglichkeit, eine Untersuchung der Funktionalität
von GFP Polyproteinen ebenfalls auf der Einzelmolekülebene durchzuführen.
Es ist denkbar, dass ein Teil der Moleküle in einem Polyprotein ihre Funktionalität verliert
und damit nicht über spektrale Eigenschaften in einer Ensemblemessung erfassbar
ist. Es ist daher von Interesse, ausgehend von GFP Monomeren, die Fluoreszenzeigenschaften
von GFP Polyproteinen zu analysieren. Für die folgenden Analysen ist daher ein
invertiertes objective-type Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskop konstruiert worden (vgl.
Anhang D.1). Für die Anregung stand Laserlicht der Wellenlänge 473 nm zur Verfügung.
Aufgrund der verbesserten Anregbarkeit von eGFP im Vergleich zu GFP bei 473 nm (vgl.
Abb. A.1) sind die folgenden Messungen mit eGFP Polyproteinen durchgeführt worden.
Mit Größenausschluss-Chromatographie sind Lösungen mit eGFP-Polyproteinen verschiedener
Länge präpariert worden. Es sind sechs verschiedene Längenbereiche aufgereinigt
worden (grüne senkrechte Balken in Abb. A.8). Laut Säulenkalibration handelt es sich dabei
um Monomer-, Dimer-, Tetramer-, Nonamer-, und 16-mer Fraktionen und eine Fraktion,
die Moleküle unbekannter Länge aus dem Bereich der Ausschlussgröße der Säule enthält.
Die Längenangaben der beiden letztgenannten Fraktionen sind fragwürdig, da die Auftrennungscharakteristik
der verwendeten Chromatographiesäule in diesem Größenbereich
unsicher ist. Die Fraktionen wurden auf etwa 1 · 10 −10 M Proteinkonzentration verdünnt
und nacheinander unter exakt den gleichen Anregungsbedingungen nach Adsorption auf
die Oberfläche eines Deckgläschens unter Anregung durch Laserlicht bei 473 nm in totaler
interner Reflektion im Fluoreszenzmikroskop untersucht. Abb. A.2 zeigt typische Fluoreszenzbilder
der verschiedenen Größenfraktionen, a) zeigt die Monomere, b) die Dimere, c)
die Tetramere, d) die Nonamere, e) die 16-mere und f) Moleküle unbekannter Länge.
Die Kamera des Mikroskops nimmt Einzelbilder auf, die digitalisiert als zweidimensionaler
Intensitätsdatensatz vorliegen. Da Helligkeiten in Bildern vom Betrachter nur schwer
evaluiert werden können, sind die Bilder der verschiedenen Fraktionen als dreidimensionale
Landschaft dargestellt. Die Höhen sind dabei direkt proportional zur Fluoreszenzintensität
pro 25 ms Belichtungszeit, wobei die Intensitätsskala für alle Bilder in Abb. A.2 identisch
ist. Die ausgeprägten Peaks in diesen Bildern werden durch einzelne, stationäre Leuchtpunkte
verursacht. Aufgrund der hochrein präparierten Probenoberfläche und Lösungen
sind die Leuchtpunkte auf oberflächen-immobilisierte eGFP Moleküle zurückzuführen. Die
sehr schmalen und flachen Peaks werden durch transiente Moleküle, Streulicht und elektronisches
Rauschen verursacht. Es ist klar zu erkennen, dass die absolute Fluoreszenzintensität
der Leuchtpunkte von Bild zu Bild zunimmt. Die Peaks in Bild b) haben in etwa