Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

2 1. Punktuelle Kraftbelastung einer Proteinstruktur
Abbildung 1.1: a) Schematische Darstellung eines AFM-Kraftspektrometers. b) Schematische
Darstellung eines Polyproteins, das zwischen Cantilever und Probenfläche eines Kraftspektrometers
gestreckt wird.
Relaxationskurven. Die Messungen können an Luft, in wässriger Lösung unter physiologischen
Bedingungen oder auch in vielen anderen Lösungsmitteln durchgeführt werden.
AFM-Kraftspektroskopie mit Proteinen ist nur in Kombination mit Methoden der Molekularbiologie
möglich. Die meisten globulären Proteinstrukturen sind nur wenige Nanometer
groß. Der Krümmungsradius der Spitze eines Kraftspektrometers liegt im Bereich
von etwa 30 nm. Die Untersuchung eines einzelnen, globulären Proteinmoleküls ist damit
kaum möglich. Einerseits können die Kontaktflächen, über die das Molekül belastet wird,
nicht genau definiert werden. Andererseits kann die Kraft-Ausdehnungsantwort einzelner
Moleküle nicht vom experimentell dominanten Hintergrund multipler Wechselwirkungen
unterschieden werden. Kraftspektroskopie an globulären Proteinen in Lösung ist jedoch
möglich, wenn die zu untersuchenden Proteine in Form von linearen Polyproteinen vorliegen,
wie in Abb. 1.1 b) schematisch dargestellt. Einzelne Untereinheiten des Polyproteins,
die unspezifisch an Cantilever und Probenfläche gebunden werden, dienen als Griffe,
über die ein solches Polyprotein zwischen Blattfeder und Probenfläche gestreckt werden
kann. Die Bindungen zwischen den Untereinheiten des Polyproteins definieren die Punkte,
über die auf diese Weise Kraft an einzelne Proteinmoleküle angelegt werden kann. Die
Kraft-Ausdehnungsantwort einzelner solcher Polyproteine führt zu einer hochspezifischen,
repetitiven Signatur (vgl. Abb. 1.1 b), die die Identifikation von Einzelmolekül-Kraftkurven
ermöglicht [89][64]. Die große Mehrheit der in der Natur vorkommenden Proteine tritt nicht
in Form von Polyproteinen auf. Es sind daher rekombinante Techniken zur Konstruktion
von künstlich verknüpften Polyproteinen entwickelt worden [64][26]. Diese Protokolle basieren
auf der mehrfachen Hintereinanderschaltung des für ein Protein kodierenden Gens