Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

D.2 Einzelmolekül-Kraftspektroskopie 99
Messung der Fluoreszenzintensität der Spitze eines AFM Cantilevers in Abhängigkeit von
der Entfernung von der Oberfläche direkt bestätigt werden (Daten nicht gezeigt). Das vom
Objektiv gesammelte Fluoreszenzlicht der Probe wird durch den bei 508 nm transparenten
dichromatischen Spiegel durchgeleitet und nach zusätzlicher Filterung durch zwei Bandpassfilter
bei 508±10 nm Wellenlänge mit einer Okularlinse (Linse 4) auf den CCD Chip
der Kamera fokussiert.
Von Linse 1 und Spiegel 1 abgesehen, ist der gesamte optische Strahlengang inklusive
Objektiv auf einer optischen Bank fest fixiert. Für die Translation der abzubildenden Probe
und Fokussierung ist daher ein Probenhalter konstruiert worden, der einerseits mit feinen
Mikrometerschrauben in drei Dimensionen relativ zum Objektiv mit einer Reichweite von
einigen Millimetern positioniert werden kann. Zusätzlich dazu ist in diesen Probenhalter
ein dreiachsiger Piezoscanner mit 100 µm horizontaler und 20 µm vertikaler Reichweite
eingelassen. Der Piezoscanner (Physik Instrumente P-517) kann elektronisch angesteuert
werden und ermöglicht eine nanometergenaue Positionierung der Probe.
Der Aufbau ist als invertiertes objective-type Mikroskop konzipiert worden, um den
probenseitigen Halbraum für verschiedene Funktionsaufsätze verfügbar zu halten. Es sind
zwei Aufsätze konstruiert worden: eine Mikrofluidikhalterung und ein Kraftspektrometer.
Die Mikrofluidikhalterung ist kompatibel für Standard-Objektträger der Größe 75x25x1
mm und kann damit insbesondere für kommerziell erhältliche Flusskammern zur Zellkultivierung
(z.B von der Firma IBIDI) sofort eingesetzt werden. Für die in Anhang A beschriebenen
Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente wurden jedoch selbstgebaute Kammern verwendet.
Diese Kammern wurden aus Standard-Deckgläschen (Firma Carl-Roth) der Größe
18x18x0.17 mm gefertigt. Die Deckgläschen wurden dazu zunächst vier Stunden in einer
Ätzlösung (1 Teil Ammoniak, 1 Teil Wasserstoffperoxid, 1 Teil doppelt-destilliertes Wasser)
gereinigt, um jegliche Oberflächenverschmutzung zu entfernen, mehrfach mit zweifachdestillierten
Wasser unter Ultraschall gespült und schliesslich aufeinandergelegt 4 bei 70 ◦ C
getrocknet. Für eine Messung wurden quer zur langen Achse abgeschnittene Pipettenspitzen
als wenige Millimeter hohe Zylinder mit wasserunlöslichem Vakuumfett auf ein
gereinigtes Deckgläschen geklebt. Die Kammern erhielten damit die Form eines umgedrehten
Doktorhutes. Auf diese Weise konnten kleine Flüssigkeitsvolumina (< 10µl) auf den
Probenträger einfach aufgetragen und auch wieder getauscht werden.
D.2 Einzelmolekül-Kraftspektroskopie
Alle kraftspektroskopischen Messungen wurden auf einem durch Ingo Schwaiger konstruierten
Atomkraftmikroskop [96] bei Raumtemperatur durchgeführt. Für die hochauflösende
Kraft-Zeitkurve in Abb. 6.1 b) wurde der vom Autor konstruierte Kraftspektrometeraufsatz
des Fluoreszenzmikroskops verwendet. Es wurden mit Gold bedampfte Cantilever des
Typs BioLever Typ A (Olympus, Tokyo, Japan) mit Federkonstanten um 30 pN/nm und
Resonanzfrequenzen in Wasser um 8 kHz verwendet. Für die Messungen wurden zunächst
4 Dies verhindert erneute Verschmutzung durch Luftkontakt.