Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

100 D. Methoden
evtl. aufgetretende Aggregate durch 10 minütige Zentrifugation bei 10000xg aus den Proteinlösungen
entfernt. Etwa 10 µl Proteinlösung wurden auf unbehandelte Glasträger aufgetragen
(GFP(117,182) und GFP(182,212) wurden auf goldbeschichtete Glasträger aufgetragen)
und für etwa 60 min bei Raumtemperatur inkubiert. Alle Kraftkurven wurden
bei konstanter Ziehgeschwindigkeit von 3.6 µm/s aufgenommen. GFP(3,132) Polyproteine
wurden bei zwei unterschiedlichen Geschwindigkeiten untersucht: (2 µm/s und 12µm/s).
D.3 Monte-Carlo Simulationen
Ziel ist es, aus experimentellen Bruchkraftverteilungen die Potentialbreite ∆x und die Höhe
der energetischen Barriere ∆G ∗ einer gefalteten Proteinstruktur zu ermitteln. Dazu wurden
Monte-Carlo Simulationen, basierend auf [88], durchgeführt. In einer solchen Simulation
wird ein virtuelles Polypeptid der initialen Konturlänge L 0 mit der Geschwindigkeit v p beginnend
mit der Ausdehnung x = 0 gestreckt. Dies führt zu einer zusätzlichen Ausdehnung
∆x = v p · ∆t in jedem Zeitschritt ∆t. Nach jedem Zeitschritt wird die aktuell wirkende
Kraft F (t) bei der aktuellen Ausdehnung x(t) über die WLC - Interpolationsformel 2.2
berechnet. Es wurden n gefaltete Proteinstrukturen in dem virtuellen Polypeptid simuliert,
die Konformationsübergänge vollführen können. Die Eigenschaften der i−ten Struktur
sind dabei über eine natürliche Übergangsrate k 0i , eine Potentialbreite ∆x i und einen
Konturlängenzuwachs ∆L i der mit einem Zusammenbruch der Struktur verbunden ist, beschrieben
worden. Zur Simulation der Bruchkinetik der Proteinstrukturen unter Kraft wird
in jedem Zeitschritt eine Übergangsrate k i (F ) (i = [0, .., n]) unter der aktuell wirkenden
Kraft F für jede der Strukturen berechnet.
k i (F ) = k 0i · exp F · ∆x i
k B T
(D.1)
Übergangsraten für den Prozess der Faltung können bei den in dieser Arbeit relevanten
Kräften vernachlässigt werden. Die Wahrscheinlichkeit für einen Konformationsübergang
der i−ten Struktur in einem Zeitschritt ∆t ist dann durch
P i = k i (F ) · ∆t
(D.2)
gegeben. Es wurden in jedem Zeitschritt die Übergangswahrscheinlichkeiten P i für alle
n Domänen berechnet und ein Wahrscheinlichkeitsstrahl wie in Abb. D.2 erzeugt. Die
∑
Zeitschritte sind so klein gewählt worden, dass n P i