Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

8 1. Punktuelle Kraftbelastung einer Proteinstruktur
Bruchereignis erhöht wieder die Kraftbelastung in der Kette, bis es zu einem erneutem
Zusammenbruch einer gefalteten Struktur kommt. Dieser Vorgang wiederholt sich, bis entweder
die letzte noch gefaltete Proteinstruktur im gedehnten Polyprotein zusammenbricht
oder das Molekül von Cantilever oder der Probenoberfläche abreisst. Beim Abriß des Moleküls
sinkt die detektierte Kraftbelastung am Cantilever wieder auf Null ab (vgl. (5)
in Abb. 1.4). In Abb. 1.4 sind ein teilweise verdecktes und sechs eindeutige Bruchereignisse
zu beobachten. Es wurde also ein GFP Polyprotein gestreckt, das aus mindestens
sieben GFP Molekülen bestand. Die Verknüpfung zwischen den einzelnen Untereinheiten
ist dabei stabiler als die Raumstruktur des GFP. Kovalente Bindungen brechen erst ab
Zugkräften um 1.5 nN [40]. Die kovalente Verknüpfung der einzelnen Moleküle über die
selektiv eingeführten Cysteine wird daher direkt durch die Beobachtbarkeit der Kraftkurve
in Abbildung 1.4 gezeigt. Würde es sich bei der Verknüpfung lediglich um eine durch
die eingeführten Cysteine induzierte Kontaktflächenwechselwirkung zwischen benachbarten
Domänen handeln, so müsste die Polyproteinkette beim Zusammenbruch der ersten
gefalteten Proteinstruktur auseinander reißen. Abb. 1.4 zeigt, dass dies nicht der Fall ist.
Es konnte die Kraft-Ausdehnungsantwort von GFP Polyproteinen in allen acht Verknüpfungsgeometrien
erfolgreich mit dem Kraftspektrometer untersucht werden. Abbildung
1.5 zeigt Ausschnitte typischer Einzelmolekül-Kraftkurven für alle untersuchten Belastungsrichtungen.
Die bereits angesprochenen multiplen Wechselwirkungen und der Abriss
der Moleküle (siehe Abb. 1.4) sind aus Gründen der Übersichtlichkeit nicht abgebildet. Alle
Kraftkurven zeigen die Eigenschaften, die durch die Kraft-Ausdehnungsantwort einzelner
Polyprotein-Moleküle verursacht werden [26]: eine Abfolge von äquidistanten Kraftzacken 2 .
Es fällt auf, dass die Längenskala, auf der Bruchereignisse stattfinden, stark zwischen
den Verknüpfungsrichtungen variiert. Beispielsweise beträgt der Abstand zwischen einzelnen
Kraftzacken für die Richtung (182,212) nur etwa 7 nm, während er für (6,221)
verknüpfte GFP Polyproteine etwa 70 nm, also das Zehnfache, beträgt. Dies ist auf die
unterschiedliche Verknüpfungsgeometrie der Polyproteine zurückzuführen. Während nach
dem Zusammenbruch einer (182,212) verknüpften GFP Struktur nur 20 Aminosäuren für
die weitere Ausdehnung innerhalb des gestreckten Polyproteins zur Verfügung stehen, werden
bei (6,221) verknüpften GFP Strukturen 215 Aminosäuren, also auch die zehnfache
Zahl an Aminosäuren, für die weitere Ausdehnung freigesetzt. Die Übereinstimmung im
relativen Längenzuwachs und der relativen Zahl an freigesetzten Aminosäuren zeigt die
spezifische Verknüpfung einzelner GFP Moleküle zu Polyproteinen an den gewünschten
Positionen in der Raumstruktur des GFP. Eine genaue Analyse des Längenzuwachses wird
im nächsten Kapitel vorgenommen.
Es fällt ebenfalls auf, dass die Kräfte, bei denen es zu Bruchereignissen in den Kraftkurven
kommt, stark zwischen den verschiedenen Belastungsrichtungen variieren. Demnach
2 Aufgrund der nichtlinearen Elastizität der Polyproteine müssen Abstände bei gleichen Kräften gemessen
werden, also z.B entlang einer horizontalen Linie in Abb. 1.4. Die fluktuierenden Bruchkräfte erwecken
den Eindruck von ebenfalls fluktuierenden Abständen zwischen den Zacken. Dies ist nicht der Fall.