Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

Anhang B
Kontrolle des Reaktionspfades bei
kraftinduziertem Bruch
Ein Kernziel dieser Arbeit ist die Untersuchung der mechanischen Eigenschaften der Raumstruktur
eines Proteins bei punktueller Kraftbelastung. Eine interessante Fragestellung ist
jedoch auch, wie sich der Reaktionspfad des kraftinduzierten Bruchs eines Proteins bei
gegebener Belastungsgeometrie verhält, wenn punktuell stabile Verknüpfungen im Inneren
des Proteins erzeugt werden. Die folgende Diskussion geht auf Messungen zurück, die
hauptsächlich von Moritz Mickler in seiner Diplomarbeit in Zusammenarbeit mit dem Autor
durchgeführt worden sind.
B.1 Reaktionspfad bei N-C terminaler Belastung des
GFP
In Vorarbeiten wurde der mechanische Entfaltungspfad des GFP bei Belastung über den
N-C Terminus charakterisiert [32][29][74]. Dazu wurden Fusionsproteine konstruiert, bei
denen jeweils ein einzelnes GFP Molekül über den N-C Terminus in ein modulares Protein
(Dictyostelium discoideum Filamin) eingefügt wurde. Abb. 1.5 zeigt die typische Kraft-
Ausdehnungsantwort dieser GFP-Fusionsproteine, während Abb. B.1 a) das typische Bruchereignis
der N-C terminal belasteten GFP Struktur vergrößert darstellt.
Ein Ergebnis dieser Untersuchungen ist, dass der N-C terminale Zusammenbruch des
GFP über mehrere metastabile Zwischenzustände erfolgt. In einem ersten Schritt kommt
es bei Kräften um 35 pN zum Ablösen einer zehn Aminosäuren umfassenden N-terminalen
α−Helix (in Abb. B.1 nicht gezeigt). Die verbleibende, die Aminosäuren 11 bis 229 umfassende
GFP Fass-Struktur (im folgenden als GFP∆α bezeichnet) widersteht Kräften bis
zu 100 pN. Der Zusammenbruch von GFP∆α erfolgt sequentiell über die Besetzung eines
kurzlebigen Zwischenzustandes. Die Präsenz dieses Zwischenzustandes manifestiert sich bei
Raumtemperatur in kurzen Zwischeniveaus in der Relaxationsphase des Cantilevers (gelber
Übergang in Abb. B.1 a). Eine Analyse des Längenzuwachses bei diesem Übergang führt
zu der in Abb. B.1 b) dargestellten Verteilung, die sich durch ein scharfes Maximum bei