Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

Anhang D
Methoden
D.1 Einzelmolekül-Fluoreszenzmikroskopie
Für die Einzelmolekül-Fluoreszenzexperimente in dieser Arbeit wurde ein invertiertes,
objective-type TIR 1 Fluoreszenz-Mikroskop zur Abbildung von fluoreszenten Einzelmolekülen
konstruiert. Abb. D.1 zeigt schematisch die Konfiguration des Instrumentes.
Kern des Mikroskops ist eine empfindliche EM-CCD Kamera (Andor iXON DU-897),
die in der Lage ist, mit jedem ihrer 512x512 Pixel einzelne Photonen zu detektieren.
Mit dieser Kamera konnten bei Belichtungszeiten von nur 25 ms die schwachen Lichtsignale
von einzelnen GFP Molekülen ausreichend vom durch elektronisches Rauschen und
Streulicht verursachten Hintergrund aufgelöst werden. Diese Zeitauflösung wurde für alle
aufgenommenen Fluoreszenzfilme verwendet. Ein weiteres wesentliches Element ist ein
100x Ölimmersionsobjektiv (Zeiss alpha Plan-Fluar) mit einer numerischen Apertur von
NA=1.45.
Für die Anregung der GFP Moleküle wurde ein continous-wave Festkörperlaser mit
einer Wellenlänge von 473 nm (Roithner Lasertechnik) und einer maximalen Leistung von
50 mW in den Anregungsstrahlengang des Mikroskops eingebaut. Der Laser wurde bei
einer optischen Leistung von 35 mW betrieben. Durch verschiedene nachgeordnete Filter
wurde die Energiedichte des Anregungslichts in der Probe auf etwa 5 kW/cm 2 eingestellt.
Das Mikroskop enthält nur die wesentlichen optischen Komponenten, um Streulicht und
Fluoreszenzlichtverluste so klein wie möglich zu halten. Das gesamte Mikroskop ist lichtundurchlässig
ummantelt worden. Der Strahlengang des Anregungslichts wurde in Anlehnung
an eine von Dr. Felix Linke für ein ellipsometrisches Mikroskop entworfenen Konfiguration
[68] aufgebaut. Linse 1 fokussiert das aufgeweitete Laserlicht auf den Spiegel 1, welcher
wiederum im Fokus der Linse 2 positioniert ist. Linse 2 erzeugt dadurch wieder parallele
Strahlenbündel, die durch Linse 3 über einen dichromatischen Spiegel (AHF Analysentechnik)
in die hintere fokale Ebene des Objektivs fokussiert werden. Linse 1 und Spiegel
1 können gemeinsam über präzise Mikrometerschrauben in zwei Richtungen verschoben
werden (durch rote Pfeile in Abb. D.1 gekennzeichnet). Diese Konfiguration ermöglicht
1 TIR = Total Internal Reflection