Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

A.2 Fluoreszenz einzelner GFP Polyproteine verschiedener Länge 75
Abbildung A.3: Fluoreszenzintensität-Zeitverhalten einzelner doppelt-cystein mutierter eGFP
Moleküle. a) (3,132) mutierte eGFP Moleküle. b) (132,212) mutierte eGFP Moleküle
Die Fluoreszenzeigenschaften einzelner eGFP Moleküle sind 1997 erstmals unabhängig
voneinander durch Pierce et al. [84] und Dickson et al. [28] beschrieben worden. Ihre Arbeiten
zeigten überraschend komplexes zeitabhängiges Fluoreszenzverhalten. Es tritt Blinken
durch die kurzzeitige Besetzung von nicht-strahlenden Dunkelzuständen, reversibles Photobleichen
(Dunkelzustände auf längeren Zeitskalen) und irreversibles Photobleichen auf.
Kurve A in Abb.A.3 a) zeigt die typische Signatur eines einzelnen GFP-Moleküls, wie es in
den ersten Arbeiten bereits beschrieben wurde. Man beobachtet ein um ein bestimmtes Intensitätsniveaus
relativ stark schwankendes Leuchtsignal, dass sehr plötzlich zum Erliegen
kommt. Dieses diskrete An/Aus -Verhalten ist die wesentliche Charakteristik eines einzeln
vorliegenden Farbstoffmoleküls. Dieses Verhalten weisen alle zwölf Fluoreszenzkurven in
Abb.A.3 a) und b) auf. Die Kurven B bis F in Abb. A.3 a) zeigen zudem Blinken als
ein weiteres typisches Element der Fluoreszenz einzelner GFP Moleküle. Dabei erlischt für
Zeiträume im Bereich von 0.1 bis mehreren Sekunden die Fluoreszenz der Moleküle, die
dann jedoch plötzlich wieder erscheint. Kurve F zeigt ein extremes Beispiel dieses Blinkverhaltens,
das betreffende eGFP Molekül befand sich die überwiegende Zeit in einem
nicht-emittierendem Dunkelzustand und wechselte selten in emittierende Zustände. Kurve
C und E zeigen ein dazu gegensätzliches Verhalten. Die Moleküle wechselten dabei etwa 50-
Mal schnell zwischen emittierenden Zuständen und Dunkelzuständen. Ebenfalls beobachtet
werden Schwankungen in der absoluten Fluoreszenzintensität der einzelnen Moleküle. Die
Ursachen dieses Effektes sind nicht vollständig geklärt, eine naheliegende Möglichkeit sind
jedoch verschiedene Orientierungen des Chromophores von oberflächenimmobilisierten Molekülen
im anregenden Feld. Zur Kontrolle sind die beschriebenen Experimente ebenfalls
mit einzelnen, nicht-mutierten nativen eGFP Molekülen durchgeführt worden. Die erhaltenen
Fluoreszenzsignale sind vollständig konsistent.
Die Ergebnisse zeigen, dass Fluoreszenzsignale einzelner eGFP Moleküle mit dem verwendeten
Aufbau detektiert werden können. Die Fluoreszenzsignatur Zweifach-Cystein mu-