Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

Anhang A
Fluoreszenzeigenschaften von GFP
Polyproteinen
A.1 Spektrale Eigenschaften von GFP Polyproteinen
Die Eigenschaften des Grün Fluoreszierenden Proteins sind seit vielen Jahren Thema aktiver
Forschung [102][106][120][53]. Ein wichtiges Ergebnis ist, dass die Fluoreszenzeigenschaften
des GFP empfindlich von der Präsenz der intakten Raumstruktur des Proteins
abhängen. Die Fluoreszenz des GFP ist ein Indikator für die korrekte Faltung des Moleküls.
Abbildungen A.1 a)-c) zeigen Anregungs- und Emissionsspektren von nativem GFP
und Zweifach-Cystein mutierten GFP-Polyproteinlösungen am Beispiel von GFP(3,212).
Es ist klar ersichtlich, dass die Mutation der zwei Cysteine und anschliessende Polymerisation
keinerlei Einfluss auf die spektralen Eigenschaften des GFP hat. Sowohl das relative
Verhältnis der Anregungsbanden der neutralen Form (bei 396 nm) und auch der anionischen
Form (bei 473 nm) als auch die Emmisionsspektren bei Anregung der neutralen
Form des Chromophores und bei Anregung der anionischen Form erscheinen vollkommen
ungestört. Dies zeigt direkt die korrekte Faltung auch der Zweifach-Cystein mutierten GFP
Moleküle in die funktionale Raumstruktur des GFP. Einzig im Falle von (6,221) mutierten
GFP Polyproteinen konnte eine spektrale Veränderung festgestellt werden. Dabei ist
(6,221) mutiertes GFP in etwa vergleichbar stark bei 396 nm und bei 473 nm anregbar.
Eine mögliche Ursache ist die Mutation 221 in der Nähe von Glutaminsäure 222, die über
den Ladungszustand des Chromophores entscheidet (siehe weiter unten). Das Emissionsspektrum
von (6,221) mutierten GFP stimmt aber mit nativem GFP vollständig überein,
so dass die korrekte Faltung der (6, 221) mutierten Moleküle ebenfalls gesichert ist. Ormö
et al. [79] berichteten 1996 über eine Punktmutation (Serin 65 zu Threonin), die in nativem
GFP zu einer Stabilisierung der anionischen Form des Chromophores führt und damit zu
einer viel stärkeren Anregungsbande bei 473 nm. Das native Serin 65 bildet im Inneren
des GFP eine Wasserstoffbrücke mit der Seitenkette der Aminosäure Glutamin 222, was
zu einer negativen Ladung an Glu222 führt. Das Chromophor des GFP befindet sich im
gefalteten Zustand nur 3.7 Å von Glu222 entfernt. Elektrostatische Abstossung verhindert