Mechanische Anisotropie von Proteinen in ...

A.4 Cysteine Engineering Protokoll 79
Es gibt eine große Zahl dieser Landungs- und Startereignisse. Darüber hinaus beobachtet
man verwischte, unscharfe Intensitätsspuren in der Darstellung. Diese sind auf eine
Vielzahl transienter, schnell in der Nähe und auf der Oberfläche diffundierender Moleküle
zurückzuführen. Die Auswirkung des Reduktionsmittels DTT sind somit:
• Rückgang der Fluoreszenzintensität pro Molekül.
• Starke Zunahme von neuen Bindungsereignissen als auch Entbindungsereignissen
• Auftreten von schnell diffundierenden Molekülen
Offensichtlich zerlegt DTT die eGFP Polyproteine in ihre monomeren Einzelteile, was sich
durch einen sofortigen Rückgang der Fluoreszenzintensität einzelner Leuchtpunkte manifestiert.
Die Zerlegung führt zu einer Vielzahl von eGFP Molekülen im Probenvolumen,
die frei diffundieren können. Ein interessanter Aspekt wird durch die Vielzahl von auftretenden
neuen Bindungs- und Entbindungsereignissen an die Oberfläche deutlich. Aus Abb.
A.6 b) geht hervor, dass lange eGFP Polyproteine eine stabile Bindung an die Oberfläche
eingehen, während die Bindung von eGFP Monomeren offenbar nur sehr kurzeitig hält. Die
Wahrscheinlichkeit, die Dissoziation eines Polyproteins von der Oberfläche zu beobachten,
ist eine bedingte Wahrscheinlichkeit, die die Dissoziation sämtlicher oberflächengebundener
Untereinheiten erfordert. Die Stationärität der einzelnen Leuchtpunkte in Abb. A.6 b) im
Vergleich zur Dynamik in Abb. A.6 d) zeigt damit unabhängig von der Fluoreszenzintensität,
dass es sich zunächst um Cystin-verknüpfte eGFP Polyproteine handelt, die durch
die Wirkung von DTT zu monomeren eGFP Molekülen reduziert werden.
A.4 Cysteine Engineering Protokoll
Für ein detailliertes Schritt-für-Schritt Cysteine Engineering Protokoll sei auf [31] verwiesen.
Die für das entsprechende Protein (hier: GFP und Ig27) kodierende DNA Sequenz
wurde in zytosolische E.coli Expressionsvektoren (pRSET5d und pET3c) über Restriktion
und Ligation in die Cloning Site der Expressionsvektoren eingebaut (Abb. A.7
Start). Die Expressionsvektoren kodieren ebenfalls für sechs Histidin-Aminosäuren, die
bei der Expression an die Proteine direkt angehängt werden (GFP: C-terminal; Ig27: N-
terminal) und die Aufreinigung der Zielproteine über Ni-NTA Affinitätschromatographie
ermöglichen. DNA-Codons, die für die zwei für als Kraftangriffspunkte gewählten nativen
Aminosäuren kodieren, wurden mit dem QuikChange Multi Site-Directed Mutagenesis
Kit zu TGC oder TGT (Cysteine-Codons) mutiert (Abb. A.7 1). Erfolgreiche Mutation
wurde durch Sequenzierung (MWG Biotech, Ebersberg) überprüft. Die mutierten Expressionsvektoren
wurden in einen E.coli Expressionsstamm (BL21-CodonPlus(DE3)-RIL,
Stratagene) transformiert und die Proteinexpression induziert (Abb. A.7 2). Die Expression
der Proteine wurde entsprechend der Anleitung des Herstellers durchgeführt. Dabei
lieferten 500 ml Zellkultur etwa 50 mg der mutierten Proteine. Die Proteinlösung wurde
mittels HisTrap HP Affinitätschromatographie-Säulen durch Elution mit aufsteigenden