termoestabilidad de sustancias antimicrobianas en la leche - RiuNet

Material y Métodos
Ácido clorhídrico 0,1 N: Se diluyeron 100 mL de ácido clorhídrico 1 N en 1 L de agua
ultra pura.
Buffer Fosfato pH 6,7: Se pesaron 2,5 ± 0,1 g de KH2PO4 y 2,5 ± 0,1 g de
K2HPO4.3H2O y se disolvieron en 1 L de agua ultra pura. A continuación se filtró la
disolución y se ajustó el pH hasta un valor de 6,7 ± 0,2.
Tampón Mcllvaine: Se pesaron 10,93 ± 0,1 g de Na2HPO4 y se disolvieron en 385 mL
de agua ultra pura. Por otro lado, se pesaron 12,9 ± 0,1 g de ácido cítrico y se
disolvieron en 615 mL de agua ultra pura. Se mezclaron las dos disoluciones y se
comprobó que el pH resultante debía presentar un valor de 4 ± 0,3.
Tampón Mcllvaine/EDTA: Se añadieron 3,72 ± 0,1g de etil diamina tetra acetato
disódico (EDTA) a 1 L de tampón Mcllvaine, mezclando bien la disolución.
2.5. ANÁLISIS CROMATOGRÁFICO DE LOS ANTIMICROBIANOS
La puesta a punto de las distintas metodologías y protocolos de trabajo que se
describen en los apartados siguientes se han realizado en el Laboratorio de Salud
Pública de la Generalitat Valenciana (Albal, Valencia) y en el laboratorio del Instituto
Lactológico de Lekunberri (Lekunberri, Pamplona), de acuerdo a la Norma
Internacional de Calidad ISO:17025 (ISO, 2005).
2.5.1. Determinación cromatográfica de los antibióticos betalactámicos
Una vez transcurrido el tiempo de tratamiento a una determinada temperatura
para cada alícuota, las muestras se llevaron, en recipiente con agua, a temperatura
ambiente y se procedió a la preparación específica de la muestra correspondiente a
los procedimientos analíticos aplicados.
El protocolo de trabajo para penicilinas y cefalosporinas fue prácticamente el
mismo. En el caso de las penicilinas el método consistió en un “cleanup” y un análisis
cromatográfico de las fracciones separadas, mientras que en el caso de las
cefalosporinas el método consistió únicamente en un único análisis cromatográfico que
permitió cuantificar directamente los antibióticos sin la necesidad de un análisis
posterior.
Las condiciones cromatográficas de lectura en el detector fueron distintas para
cada grupo de betalactámicos, por lo que, una vez procesadas y analizadas las
muestras de penicilinas, se modificaron las condiciones de trabajo del cromatógrafo y
se analizaron, a continuación las muestras fortificadas con las cefalosporinas.
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