termoestabilidad de sustancias antimicrobianas en la leche - RiuNet

Material y Métodos
2.5.1.1. Preparación y extracción de la muestra
104
En un matraz de 125 mL se añadieron 10 ± 0,01 g de la muestra de leche
adicionada y 2 mL de cloruro de tetraetilamonio 0,2 M. Se colocó el matraz en un
agitador magnético y se añadió a continuación 38 ± 0,4 mL de acetonitrilo desde una
bureta mientras la muestra estaba en agitación, para poder realizar así la
desproteinización de la leche.
A continuación se dejó reposar la muestra durante cinco minutos, para
conseguir una separación de fases y se filtró el sobrenadante a través de lana de
vidrio a un kitasatos y se añadió 1 mL de agua destilada para asegurar la eliminación
del acetonitrilo durante la evaporación.
El matraz kitasatos se colocó en un baño termostático a 65 ± 2º C y se conectó
a vacío con el fin de evaporar el colectado bajo presión reducida hasta prácticamente
sequedad.
El residuo se redisolvió con pequeñas porciones de agua destilada de 1 mL
hasta un volumen de 3 mL, que se recolectó en un tubo graduado de 10 mL. Después
de homogeneizar en el vortex 30 segundos y mantener 5 minutos en ultrasonidos, con
ayuda de una jeringa se filtró el colectado a un vial de 4 mL a través de un filtro de
PVDF de 25 mm y 0,45 µm.
Este vial se insertó en el sistema cromatográfico de “cleanup” para separar las
diferentes fracciones en las que eluirían los antibióticos betalactámicos.
2.5.1.2. Separación de fracciones por “cleanup”
Tras la puesta en marcha y estabilización del sistema cromatográfico de
“cleanup” se insertó en el carro la del equipo cromatográfico la siguiente serie
analítica:
- Vial 1: Agua ultra pura
- Vial 2: Control negativo de la muestra de leche
- Vial 3: Control positivo de identificación. Se añadieron 100 ± 5 µL de las
disoluciones madre (1000 µg/g) de los distintos antibióticos a 10 g de la
leche, obteniendo muestras con una concentración de 10 µg/g
- Vial 4: Control positivo de cuantificación. A una muestra de leche de 10 g se
le añadieron los volúmenes necesarios de cada solución diluida (10 µg/g)
para obtener una muestra de leche con una concentración final de
antibióticos igual al límite de cuantificación de cada uno de ellos