Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

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Procédures expérimentales Ces cellules possèdent un noyau arrondi central et de nombreuses et volumineuses granulations arrondies, éosinophiles nettes. En revanche, les lames destinées au comptage des mastocytes ont été traitées selon une coloration de Giemsa, qui permet de mieux visualiser les granulations mastocytaires, qui prennent ainsi une teinte violet-pourpre vive (Figure n°15C). Figure n°15 : Coupes histologiques de caillette d’ovins infestés par H. contortus, mettant en évidence des polynucléaires éosinophiles (A, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400), des globule leucocytes (B, coloration Hémalun-Eosine, grossissement 400) et des mastocytes (C, coloration Giemsa, grossissement 400). 100
6.1.4. Immunohistochimie sur coupes en paraffine Procédures expérimentales Le protocole utilisé pour l’immunohistochimie est celui décrit par Andréoletti et al. (2002). Les lames sont chauffées à 56°C pendant une nuit avant d’être déparaffinées et réhydratées (différents bains de 5 minutes : toluène, éthanol absolu, éthanol 95° puis rinçage à l’eau courante). Les sections tissulaires sont alors autoclavées pendant 10 minutes à 121°C dans une solution de tampon citrate 10mM (pH 6.15) afin de démasquer les épitopes antigéniques, la fixation au formaldéhyde pouvant créer des ponts méthylènes sur les protéines et ainsi « cacher » certains antigènes d’intérêt. Les peroxydases endogènes sont inhibées par incubation des lames dans une solution de peroxyde d’hydrogène 30% dans du méthanol pendant 30 minutes à température ambiante. Une incubation ultérieure de 20 minutes dans une solution de PBS contenant 20% de sérum normal de chèvre permet de bloquer les sites non spécifiques d’attache des anticorps primaires. L’incubation de l’anticorps primaire se fait à température ambiante pendant 1 heure. Elle est suivie d’une incubation de 30 minutes d’un anticorps secondaire de chèvre dirigé contre les chaînes lourdes d’immunoglobulines de souris et de lapin, dilué au 1/100 ème . Un complexe streptavidine-peroxydase dilué également au 1/100 ème est ensuite appliqué pendant 30 minutes. La révélation est réalisée avec de la 3,3’-diaminobenzidine (DAB) (ChemMate Detection Kit Peroxydase/DAB, DAKO, référence K5001). Les sections tissulaires sont finalement contre-colorées à l’Hématoxyline de Mayer. Dans notre travail, les anticorps primaires utilisés ont été : - un anticorps spécifique des macrophages / monocytes : mouse anti-human CD68, clone Ki-M6 (SEROTEC), dilution 1/150 ème , - un anticorps spécifique des lymphocytes B : mouse anti-human CD20-like, clone BLA-36 (NOVOCASTRA), dilution 1/50 ème , - un anticorps spécifique des lymphocytes T : rabbit anti-human CD3, A0542 (DAKO), dilution 1/100 ème , La réactivité de ces différents anticorps contre les antigènes ovins avait été préalablement vérifiée (Ramos-Vara et al., 1994 ; Andréoletti et al., 2002 ; Tabouret et al., 2003 ; Valentine et McDonough, 2003). 101
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