Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

Procédures expérimentales
lymphocytes T via le complexe majeur d’histocompatibilité (CMH) de type II. Les signaux
transduits suite à l’interaction entre le CMH II et l’antigène via le récepteur lymphocytaire T
entraîne leur activation et leur progression dans le cycle cellulaire.
7.2. Technique
7.2.1. Préparation des cellules
- A partir du sang circulant : une prise de sang est effectuée à la jugulaire sur tube
EDTA et dilué volume à volume dans du RPMI 1640. Le sang ainsi dilué est
déposé sur de l’Histopaque 1.077 (Sigma Diagnostics) et centrifugé pendant 30
minutes à 1100g. Les cellules mononucléées sont recueillies et lavées deux fois
dans du RPMI 1640 (deux centrifugations de 12 minutes à 200g et 4°C séparant les
lavages).
- A partir d’un nœud lymphatique : un fragment de nœud lymphatique est prélevé
aseptiquement lors de l’autopsie et coupé en deux parties égales, qui sont broyées
dans un gaze stérile au dessus d’une boîte de Pétri contenant du RPMI 1640. La
suspension cellulaire obtenue est alors déposée sur l’Histopaque 1.077 et les
cellules mononucléées sont obtenues et lavées comme précédemment décrit.
7.2.2. Mise en culture et stimulation des cellules mononucléées
Les cellules sont re-suspendues dans un milieu de culture adapté (RPMI 1640, 20% de sérum
de veau fœtal, 1% pénicilline-streptomycine, 1% glutamine). Leur viabilité est appréciée par
une coloration d’exclusion au Bleu Trypan (colore en bleu les cellules mortes).
Ces cellules sont mises en culture à raison de 12 x 10 5 cellules par puits dans des plaques 96
puits (Microtest 96, Flacon, Becton-Dickinson) pendant 7 jours à 37°C dans une atmosphère
humide à 5% de CO2.
Trois modalités de culture sont mises en place :
- culture en présence d’un agent mitogène, la PHA (phytohémagglutinine, PHA-L,
Sigma) à raison de 10 µg/mL : ces puits de culture représentent un témoin positif
de prolifération des lymphocytes face à un mitogène non spécifique,
- culture en présence d’antigènes parasitaires de vers adultes ou de larves 4
(antigènes d’excrétion-sécrétion), ou d’antigènes totaux de larves 3, issus de H .
contortus ou T. colubriformis en fonction des expérimentations (concentrations
d’antigènes variables entre 10 et 20 µg/mL),
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