Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

Procédures expérimentales
de la pénicilline (100 UI/mL) et de la streptomycine (1 mg/mL), ces vers sont maintenus à
37°C, pendant une nuit environ (H. contortus) ou 48 heures (T. colubriformis), sous 5 % de
CO2 dans la même solution de PBS à raison d’une densité maximale de 50 adultes par puits
de plaque de culture cellulaire pour H. contortus, et de 200 adultes par puits pour T.
colubriformis. Le surnageant de cette culture (produits d’excrétion-sécrétion) est alors collecté
et filtré (0.2 µm).
L’obtention des larves L4 nécessite également une infestation similaire d’un ovin donneur,
avec une euthanasie réalisée seulement 4 jours après l’infestation. Les cinq premiers mètres
d’intestin grêle sont mis à tremper dans du sérum physiologique à 37°C pendant 2 heures pour
faire sortir les larves de la muqueuse. Le contenu intestinal est ensuite filtré sur un appareil de
Büchner : brièvement, les larves ainsi que les débris alimentaires sont aspirés et retenus sur un
filtre Wathmann par un système de pompe à vide. Une fois tout le contenu absorbé sur le
papier, ce dernier est retourné dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS
additionnée d’antibiotiques (concentrations identiques à celles décrites pour l’obtention des
vers adultes). Les larves L4, mobiles, passent activement dans cette solution et sont ensuite
mises en culture à raison de 1000 larves par puits de plaque de culture, pendant environ 48-72
heures. Le surnageant de culture obtenu contient les produits d’excrétion-sécrétion de ces
larves.
Les antigènes de larves L3 sont obtenus après trois cycles de congélation / décongélation des
larves (-70°C ; 25°C), homogénéisation à 4°C et centrifugation à 30 000g pendant 30 minutes
à 4°C.
La concentration en protéines de ces surnageants est déterminée par la méthode de Lowry et
al. (1951).
5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA
Les concentrations optimales des réactifs utilisés (anticorps secondaire, conjugué), des
préparations antigéniques et les dilutions des échantillons (mucus ou sérum) sont déterminées
par séries de test sur des échantillons positifs (mucus ou sérum d’ovins immunisés avec le
parasite d’intérêt) et négatifs (mucus ou sérum d’ovins contrôles, non-infestés).
Les paramètres retenus sont présentés dans les tableaux n°11 (H. contortus) et n°12 (T.
colubriformis). Ils permettent d’obtenir un bruit de fond minimal et une distinction maximale
entre les échantillons positifs et négatifs.
95