Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

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Procédures expérimentales des cellules CD4+ triées ainsi que le pourcentage d’enrichissement de ces cellules par rapport à la population ganglionnaire totale de départ. 4.4. De l’ARN à l’ADN complémentaire (ADNc)… Dans nos travaux, l’étape de RT-PCR (Reverse Transcriptase PCR) a été effectuée sur une quantité totale de 2 µg d’ARN pour chaque échantillon, ajustée à 16 µL dans de l’eau ppi. Les 2 µg d’ARN sont préalablement digérés pendant une heure à 37°C en présence d’1U de DNAse RNAse-free, afin d’éliminer toute trace d’ADN génomique. Un premier mix contenant les oligonucléotides (Random Primers, Invitrogen, référence 48190-011) est rajouté à chaque échantillon, suivi d’une incubation de 10 minutes à 65°C. Un deuxième mix, contenant des dNTP et l’enzyme de reverse transcription (M-MLV, Invitrogen, référence 28025-013, 400 unités/échantillon) est ensuite ajouté aux échantillons. Après une incubation d’une heure à 42°C, la réaction de transcription est stoppée par une incubation de 5 minutes à 95°C. Les ADNc ainsi obtenus sont alors congelés à –20°C en attente d’être utilisés pour la PCR quantitative. 4.5. PCR quantitative Les échantillons d’ADNc sont utilisés dilués au 1/100 ème et en duplicate pour l’étape de PCR quantitative. Les couples d’amorces utilisées ont été dessinées à l’aide du logiciel Primer Express Software (Applied Biosystems) et sont listées dans le Tableau n°10. Pour être utilisables en système SYBR Green, ces primers doivent posséder certaines caractéristiques : - température d’hybridation d’environ 60°C - %GC entre 40 et 60 - absence d’hybridation des deux amorces entre elles (absence de dimérisation) et absence de repliement d’une amorce sur elle même (repliement en épingle). Dans le cas où la séquence du gène des cytokines d’intérêt était connue pour l’espèce ovine, les primers ont été déterminés directement à partir de celle-ci (cas des gènes de la β-actine, des interleukines (IL) 3, 4, 5, 10, 12, du TNF-α et de l’interféron-γ). Dans le cas contraire (IL- 13 et Eotaxine), l’alignement entre les séquences des gènes des cytokines connues dans d’autres espèces animales (bovin, caprin, souris, rat…) a permis d’obtenir une séquence dite « consensus » sur laquelle les primers ont été déterminés. Ceux-ci ont été utilisés en PCR classique sur des cellules sanguines ovines (Peripheral Blood Mononuclear Cells stimulés 92
Procédures expérimentales avec un mitogène tel que la Phytohématoagglutinine ou PHA) afin de tester leur compatibilité avec l’espèce ovine (obtention d’une bande sur gel au poids moléculaire de la cible attendue). Cytokine Ovine Beta-actin Ovine IFN-γ Ovine IL-4 Ovine IL-10 Ovine TNF-α Ovine IL-12p40 Ovine IL-13 Ovine Eotaxin Ovine IL-5 Ovine IL-3 Séquence sens ACCAGTTCGCCATGGATGAT ATCTCTTTCGAGGCCGGAGA GGAGCTGCCTGTAGCAGACG CTGAGAACCATGGGCCTGAC CCCGTCTGGACTTGGATCCT GAATTCTCGGCAGGTGGAAG CACTCAGCATCCTCTTGGTCC ACAAGAAAATCTGTGTTGATCCCC CTGCTGATAGGTGATGGGAACTT AAGAATATCCTGGCGAATAAGAGC SEQUENCE ANTI-SENS AGCCGTTGTCAACCACGAG ATTGCAGGCAGGAGAACCAT TTCTCAGTTGCGTTCTTTGGG TCTCCCCCAGCGAGTTCAC TGCTTTTGGTGCTCATGGTG GTGCTCCACGTGTCAGGGTA TGATCAGCATCTCCAACTGCA CCATGGCATTCTGGACCC GGTGATTTGTATGCTGAGGAGTAGG GAACGCTTTCAGGTTTGCCT Tableau n°10 : Séquences sens et anti-sens des amorces utilisées en PCR quantitative. La quantification des échantillons analysés en PCR quantitative a été réalisée au moyen d’une gamme externe standard de plasmide déterminée pour chaque cytokine testée (séries de dilution au 1/10 ème , couvrant généralement un nombre de copies allant de 1.10 7 à 1.10 1 ) . Ces plasmides ont été obtenus après clonage des produits de PCR classique pour chaque cytokine en système TOPO TA Cloning® Kit (Invitrogen). Les résultats obtenus pour chaque cytokine ont été normalisés par rapport au niveau d’amplification du gène de ménage β-actine et donc exprimés en nombre de copies relatives à celle-ci. Enfin, pour chaque réaction ont été inclus des contrôles négatifs sans ADNc (Non 93
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