Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

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Procédures expérimentales template control ou NTC) afin de vérifier l’absence d’amplification non spécifique et l’absence de dimérisation des amorces. 5. EXPLORATION DE LA REPONSE HUMORALE GENERALE GENERALE ET LOCALE La réponse humorale ou réponse « anticorps » peut être étudiée à l’échelle de l’organisme (réponse générale ou systémique) ou à l’échelle de l’organe cible de l’infestation parasitaire (réponse locale) soit, dans notre cas, la caillette (H. contortus) ou le duodénum (T. colubriformis). Dans le sérum ou le mucus digestif sont ainsi mis en évidence des anticorps, principalement des immunoglobulines (Ig) A ou IgG, spécifiques des antigènes parasitaires, et correspondant à différents stades de développement des vers, par une méthode ELISA (Enzyme Linked ImmunoSorbent Assay). 5.1. Collecte des prélèvements La réponse humorale générale est étudiée au niveau sérique. Une prise de sang sur tube sec est réalisée sur l’animal par ponction jugulaire, et le sérum est récupéré puis congelé à –20°C après une centrifugation de 5 minutes à 5000 rpm. La réponse humorale locale est explorée au niveau du mucus abomasal ou intestinal. Le mucus est récupéré sur des bandelettes de papier filtre de 5 cm de long sur 1 cm de large, imprégnées de PBS, déposées sur la muqueuse digestive pendant 5 minutes. Ces bandelettes sont ensuite placées dans une solution de PBS sous agitation pendant 2 heures à température ambiante. Les surnageants obtenus sont alors congelés à –20°C pour analyse ultérieure. 5.2. Préparation des antigènes Différentes préparations antigéniques ont été utilisées pour mettre en évidence des anticorps spécifiques : - produits d’excrétion-sécrétion de vers adultes (PES), - produits d’excrétion-sécrétion de larves de stade L4 (non disponibles pour H. contortus en raison de la grande difficulté d’isoler des larves L4 de la paroi de la caillette), - broyats totaux de larves L3. L’obtention de vers adultes est réalisée par infestation massive (50 000 larves infestantes) d’un mouton donneur, euthanasié 30 jours après le challenge. Les vers adultes sont isolés du contenu alimentaire abomasal ou duodénal. Après plusieurs lavages dans du PBS contenant 94
Procédures expérimentales de la pénicilline (100 UI/mL) et de la streptomycine (1 mg/mL), ces vers sont maintenus à 37°C, pendant une nuit environ (H. contortus) ou 48 heures (T. colubriformis), sous 5 % de CO2 dans la même solution de PBS à raison d’une densité maximale de 50 adultes par puits de plaque de culture cellulaire pour H. contortus, et de 200 adultes par puits pour T. colubriformis. Le surnageant de cette culture (produits d’excrétion-sécrétion) est alors collecté et filtré (0.2 µm). L’obtention des larves L4 nécessite également une infestation similaire d’un ovin donneur, avec une euthanasie réalisée seulement 4 jours après l’infestation. Les cinq premiers mètres d’intestin grêle sont mis à tremper dans du sérum physiologique à 37°C pendant 2 heures pour faire sortir les larves de la muqueuse. Le contenu intestinal est ensuite filtré sur un appareil de Büchner : brièvement, les larves ainsi que les débris alimentaires sont aspirés et retenus sur un filtre Wathmann par un système de pompe à vide. Une fois tout le contenu absorbé sur le papier, ce dernier est retourné dans une boîte de Pétri contenant une solution de PBS additionnée d’antibiotiques (concentrations identiques à celles décrites pour l’obtention des vers adultes). Les larves L4, mobiles, passent activement dans cette solution et sont ensuite mises en culture à raison de 1000 larves par puits de plaque de culture, pendant environ 48-72 heures. Le surnageant de culture obtenu contient les produits d’excrétion-sécrétion de ces larves. Les antigènes de larves L3 sont obtenus après trois cycles de congélation / décongélation des larves (-70°C ; 25°C), homogénéisation à 4°C et centrifugation à 30 000g pendant 30 minutes à 4°C. La concentration en protéines de ces surnageants est déterminée par la méthode de Lowry et al. (1951). 5.3. Détermination des conditions optimales pour l’ELISA Les concentrations optimales des réactifs utilisés (anticorps secondaire, conjugué), des préparations antigéniques et les dilutions des échantillons (mucus ou sérum) sont déterminées par séries de test sur des échantillons positifs (mucus ou sérum d’ovins immunisés avec le parasite d’intérêt) et négatifs (mucus ou sérum d’ovins contrôles, non-infestés). Les paramètres retenus sont présentés dans les tableaux n°11 (H. contortus) et n°12 (T. colubriformis). Ils permettent d’obtenir un bruit de fond minimal et une distinction maximale entre les échantillons positifs et négatifs. 95
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