Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

Procédures expérimentales
être estimé grâce à la mesure de l’hématocrite (ou pourcentage d’hématies dans le sang). Les
valeurs physiologiques de l’hématocrite chez les ovins sont de 30-35%.
Le sang est récupéré sur tube EDTA à la jugulaire (le tube servant à estimer l’éosinophilie
sanguine peut également permettre la mesure de l’hématocrite). L’analyse doit cependant être
réalisée dans la demi-journée suivant le prélèvement afin d’éviter l’hémolyse. Après
homogénéisation, le sang est prélevé dans un tube capillaire aux extrémités colmatées par de
la pâte à modeler. Une centrifugation pendant 5 minutes à 4000 rpm permet la séparation du
culot de globules rouges, des globules blancs (buffy-coat) et du plasma. L’hématocrite est
déterminé grâce à une grille de lecture et le résultat exprimé en pourcentage.
4. ETUDE DE L’ORIENTATION DE LA REPONSE IMMUNITAIRE
Nous avons choisi d’étudier l’orientation de la réponse immunitaire (polarisation Th1 ou Th2)
par une technique de PCR quantitative en système « TaqMan » (GeneAmp 5700 Sequence
Detector, Perkin Elmer). Le terme de TaqMan représente, par abus de langage, une
contraction des mots Taq Polymérase et PacMan, et désigne l’appareil de mesure utilisé dans
cette technique.
4.1. Principe de la PCR quantitative
La PCR correspond à l’amplification d’un fragment d’ADN spécifique, grâce à l’utilisation
d’une ADN polymérase (Taq Polymérase), et d’un couple d’amorces (« primers »)
spécifiques. L’intensité de l’amplification de l’ADN ainsi obtenue peut être représentée par
une courbe d’allure sigmoïde, dépendante du nombre de cycles de PCR (abscisse) et de
l’intensité de la fluorescence émise (ordonnée). La fluorescence est obtenue par l’utilisation
d’un agent intercalant : le SYBR Green I, colorant qui ne devient fluorescent que lorsqu’il se
lie à l’ADN double brin. L’utilisation de ce colorant permet de s’abstenir de la conception de
sondes spécifiques. Toutefois, la fluorescence mesurée peut alors provenir d’une
amplification non spécifique, d’où l’intérêt de s’assurer de la spécificité du couple d’amorces
utilisé ainsi que des produits de PCR.
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