Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

Procédures expérimentales
suivie d’un « nettoyage » des ARN selon le protocole RNA Clean Up Qiagen (RNEasy Mini
Kit).
La concentration en ARN de chaque échantillon est obtenue par spectrophotométrie à la
longueur d’onde 260 nm. La qualité / dégradation des ARN peut également être évaluée par
électrophorèse en gel d’agarose à 1%, comportant du bromure d’éthidium.
4.3. Isolement des cellules CD4 positives du nœud lymphatique abomasal pour extraction
spécifique des ARN de cette fraction cellulaire
Le nœud lymphatique abomasal est retiré lors de l’autopsie et plongé dans une solution de
PBS (Phosphate Buffered Saline) 1X sur la glace. Il est broyé à l’aide d’un tamis cellulaire
muni de pores de 40 µm de diamètre et les cellules obtenues sont collectées dans une solution
d’HBSS (Hank´s Balanced Salt Solution). Après deux lavages, 1.10 7 cellules sont remises en
suspension dans 500 µL de tampon FACS (PBS 1X, 2mM EDTA et 0.5 % de BSA (Bovine
Serum Albumin)) et incubées pendant 30 minutes sur la glace en présence de l’anticorps
primaire dirigé contre l’épitope CD4 marqué FITC (Mouse anti-ovine CD4 :FITC,
SEROTEC, référence MCA2213F) dilué au 1/150 ème . Après lavage, le culot cellulaire est
repris dans 80 µL de tampon FACS et incubé 15 minutes à 4°C avec 20 µL de billes
magnétiques couplées à un anticorps monoclonal anti-FITC (Anti-FITC Microbeads, Miltenyi
Biotec, référence 130-048-701). Les cellules sont alors reprises sous un volume de 1 mL de
tampon FACS après deux lavages, et triées au moyen d’un AUTOMACS® (Miltenyi Biotec)
selon le programme POSSEL-D (tri en double colonne, permettant d’obtenir un excellent
degré de pureté). Brièvement, l’appareil de tri cellulaire est muni de deux colonnes de tri qui
retiennent les billes magnétiques ayant accroché les cellules d’intérêt. L’élution ultérieure
permet de récupérer une fraction positive (contenant dans notre cas les cellules positives
CD4+) et une fraction négative (cellules non marquées par l’anticorps primaire). Toutes les
étapes de lavage sont réalisées à 4°C afin de préserver au maximum l’intégrité des cellules.
La fraction positive d’intérêt récupérée après tri cellulaire est alors conservée en tampon RLT
à –70°C, à raison de 1.10 6 cellules dans 350 µL de RLT additionné de β-mercaptoéthanol.
L’ARN de ces cellules sera alors extrait selon le protocole Qiagen décrit ci-dessus (Qiagen
RNEasy Mini Kit).
Après chaque tri cellulaire, une analyse de confirmation a été effectuée en cytométrie de flux
(analyse FACS) sur un échantillon des fractions cellulaires obtenues, afin de vérifier la pureté
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