Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

Procédures expérimentales
Figure n°14 : Représentation schématique de l’amplification par PCR quantitative
4.2. Du tissu à l’ARN…
d’échantillons d’ADN.
Les échantillons collectés à l’autopsie (fragments de muqueuse, de nœud lymphatique) sont
immédiatement congelés en azote liquide dans une solution de TRIzol Reagent (Invitrogen,
référence 15596-018) puis conservés à –70°C jusqu’à utilisation.
Les échantillons, placés dans des tubes à vis contenant des microbilles de céramique, sont
alors broyés et homogénéisés par un ribolyseur (Hybaid RiboLyser TM ), lors de deux cycles
d’agitation de 30 secondes à une vitesse de 4.5. Pour éviter une dégradation des ARN lors de
cette étape, la vitesse utilisée n’est pas maximale (ce qui évite l’échauffement des tubes) et les
échantillons sont immédiatement placés sur la glace entre et après les cycles de broyage.
L’extraction ultérieure d’ARN fait appel à une contraction de deux protocoles : une extraction
classique manuelle utilisant un mélange TRIzol/chloroforme, suivie d’un passage sur des
colonnes d’extraction prévues à cet effet. Brièvement, 50 µL d’échantillon broyé sont
mélangés à 950 µL de TRIzol auxquels sont ajoutés 200 µL de chloroforme. Les échantillons
sont alors centrifugés pendant 15 minutes à 12 000g à température ambiante. Cette étape
permet de séparer les ARN (surnageant après centrifugation) des protéines et de l’ADN.
Afin d’obtenir des ARN dénués au maximum d’inhibiteurs de PCR, classiquement présents
dans le contenu digestif (sels biliaires par exemple …), cette première étape d’extraction est
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