Régulation des populations de Nématodes gastro-intestinaux ...

5.4. Technique ELISA
Procédures expérimentales
La méthode employée dans nos travaux est un test ELISA de type indirect. Des plaques à
fond plat (Nunclon, VWR International) sont coatées pendant une nuit à 4°C avec 100
µL/puits d’antigène dilué dans un tampon sodium carbonate. Ces plaques sont ensuite lavées
deux fois avec du PBS pH=7.2 contenant 0.1% de Tween 20 (PBS-T). Afin de minimiser la
fixation non spécifique des anticorps, les plaques sont ensuite incubées pendant une heure à
37°C avec 200 µL/puits de PBS-T contenant 5 % de lait écrémé (PBS-TM). Les plaques sont
alors vidées de cette dernière solution, incubées pour une heure à 37°C avec le sérum ou le
mucus, pur ou à la dilution optimale préalablement déterminée, puis lavées trois fois avec du
PBS-T.
- Mise en évidence des IgG totales : les plaques sont incubées avec 100 µL/puits
d’anticorps secondaire directement couplé à HRP (donkey anti-sheep IgG-HRP, SIGMA,
référence A3415)
- Mise en évidence des IgA : 100 µL/puits de l’anticorps secondaire (mouse IgG1 anti-
IgA bovine/ovine, SEROTEC, référence MCA628) sont incubés pendant une heure avant
d’appliquer 100 µL/puits de conjugué couplé à HRP (Goat anti-mouse IgG1-HRP,
SEROTEC, référence STAR81P), ces deux étapes étant séparées par trois lavages des
plaques.
La révélation est alors réalisée selon une réaction colorimétrique par une incubation des
plaques avec 100 µL/puits de 2,2’-azino-bis (3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid, ABTS)
pendant une heure à 37°C. La réaction est stoppée en plaçant les plaques pendant 15 minutes
à 4°C.
La densité optique est alors mesurée à la longueur d’onde 405 nm par un lecteur de plaques
(Microplate Reader, Dynatech). Le résultat final a été exprimé en densité optique corrigée,
c’est à dire la densité optique obtenue par le lecteur à laquelle a été retirée la valeur obtenue
pour les puits « blancs » contrôles, ne contenant que du PBS initialement.
6. ETUDE DE LA REPONSE CELLULAIRE LOCALE
La réponse cellulaire locale (dans la muqueuse abomasale lors d’infestation par H. contortus,
et dans la muqueuse du duodénum proximal lors d’infestation par T. colubriformis) a été
étudiée par un dénombrement des différentes populations cellulaires présentes dans la
muqueuse. Ont été ainsi dénombrées :
98