Manual para la comercialización y producción de semillas - Inia

CARACTERIZACION DE LOS MATERIALES DE BASE Y REPRODUCCIÓN
indicar que el número de isoenzimas disponibles para analizar es relativamente bajo, y
cada una de ellas suele presentar pocos alelos (6-10). De este modo, la potencia de diagnóstico
a menudo es demasiado baja para los propósitos del estudio.
Marcadores de ADN
Los marcadores de ADN son utilizados preferentemente, pues suponen el análisis directo
del material genético y porque pueden registrar un número virtualmente ilimitado de
polimorfismos (mutaciones puntuales, inserciones/deleciones, reagrupamientos), localizables
en regiones concretas del genoma.
• RFLP (restriction fragment length polymorphism). Esta técnica se basa en la digestión
del ADN con enzimas de restricción. Estos enzimas reconocen secuencias
específicas del ADN y cortan la doble hebra. Tras la digestión con uno de estos enzimas,
se separan los fragmentos resultantes en un gel de electroforesis y se detectan
por hibridación con una sonda específica (generalmente marcada con radiactividad),
homóloga a un determinado fragmento del genoma. Cuentan con la
desventaja (además del uso de radiactividad) de requerir cantidades relativamente
elevadas de ADN, y de analizar pocos loci (pocas dianas para la hibridación de la
sonda) en cada experimento.
• RAPD (random amplified polymorphic DNA). Se basan en la amplificación por
PCR (reacción en cadena de la polimerasa) de fragmentos de ADN comprendidos
entre zonas homólogas a los cebadores (primers) utilizados en la amplificación. Los
fragmentos amplificados se separan por electroforesis y se detectan mediante una
tinción inespecífica (generalmente, bromuro de etidio). Los cebadores tienen unas
secuencias arbitrarias; por tanto, los RAPDs son marcadores universales (funcionan
en cualquier especie), pero anónimos (se desconoce qué se está amplificando). La
interpretación de los geles de electroforesis se realiza por presencia o ausencia de
fragmentos para cada uno de los tamaños considerados; se trata, por tanto, de marcadores
dominantes.
• Microsatélites, SSR (simple sequence repeat). Los microsatélites son regiones que
incluyen un número variable de repeticiones de una secuencia sencilla: (X) n . El motivo
de repetición puede estar constituido por uno, dos, tres o incluso cuatro nucleótidos
y se encuentran repartidos por todo el genoma nuclear y también en el de los
plastidios (cloroplastos y mitocondrias). En la replicación del ADN en la división celular
la hebra en síntesis y la hebra molde pueden deslizarse una sobre otra, provocando
una variación en el número de repeticiones del ADN copia respecto al original.
Esto hace que los microsatélites sean regiones hipervariables del genoma, con
la existencia de un número elevado de alelos. El análisis de microsatélites se basa en
la amplificación por PCR de estas repeticiones, empleando para ello cebadores
homólogos a las regiones flanqueantes. Se emplean cebadores marcados (generalmente
con algún fluoróforo), lo que permite la detección de los fragmentos amplificados,
una vez separados en función de su tamaño por electroforesis.
279