SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

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dans la perception de la douleur. Les quelques données de pharmacologie comportementale chez les rongeurs, utilisant des inhibiteurs non-sélectifs de ces canaux, confortent ce rôle important dans la physiopathologie des nocicepteurs et de la sensation de douleur 3,4 . L‟identification des gènes Ca V 3 a rendu possible l‟utilisation d‟approches génétiques pour valider l‟utilité potentielle de bloquer les canaux calciques de type-T pour réduire la perception de la douleur. Pour cibler les neurones nocicepteurs chez le rat, nous avons réalisé des injections dans l‟espace intrathecal (autour de la moelle épinière) de petites séquences synthétiques d‟ADN « antisens » qui s‟hybrident spécifiquement sur chacun des trois ARN messagers générant des canaux de type-T. Comme l‟ARN messager est le précurseur de la protéine dans la cellule, l‟hybridation de l‟ADN antisens sur l‟ARN bloque sélectivement la synthèse de la protéine. Cette approche d‟inhibition (communément appelée knock-down) via l‟injection intrathecale d‟antisens a été validée dans plusieurs études, et a montré toute son efficacité pour identifier des gènes qui participent à la détection de la douleur. En utilisant cette approche expérimentale, nous avons mis en évidence que l‟un des trois gènes codant pour les canaux de type-T (Ca V 3.2) a un rôle primordial dans l‟excitabilité des nocicepteurs et donc dans la perception de la douleur 5 . L‟inhibition de l‟expression de Ca V 3.2 dans les neurones nocicepteurs a ainsi pour conséquence une inhibition remarquable des réactions comportementales à des stimuli douloureux chez des animaux sains (effet analgésique), mais surtout chez des animaux « neuropathiques » mimant les pathologies humaines de la douleur chronique (effet anti-hyperalgésique, figure1). De surcroît, ces animaux neuropathiques, tout comme bon nombre de patients douloureux chroniques, perçoivent ou interprètent des stimuli indolores comme sensations nociceptives (état d‟allodynie). Comme pour traiter l‟hyperalgésie, peu de médicaments ont une action anti-allodynique efficace. A l‟inverse, l‟antisens dirigé contre Ca V 3.2 s‟est révélé comme possédant une action anti-allodynique spectaculaire en permettant de normaliser la perception de la douleur aux niveaux physiologiques chez des animaux neuropathiques. En conclusion, l‟étude menée à l‟Institut de Génomique Fonctionnelle de Montpellier a mis en évidence que l‟application intrathécale d‟un antisens dirigé contre le gène Ca V 3.2 engendre une inhibition de l‟expression et de l‟activité des canaux de type-T dans les nocicepteurs. Cette inhibition « génétique » démontre la fonction importante du canal de type-T généré par Ca V 3.2 dans la perception de la douleur physiologique et pathologique. Compte tenu, d‟une part de l‟absence d‟effets indésirables liés à la déplétion des nocicepteurs en canaux Ca V 3.2, et d‟autre part de l‟abondance de Ca V 3.2 dans ces nocicepteurs ; des molécules capables de bloquer ces canaux seraient vraisemblablement douées de propriétés anti-douleur tout en étant dénués d‟effets secondaires. Dans cette perspective la découverte de molécules antagonistes sélectives des canaux de type-T devrait être d‟un grand intérêt pour la prise en charge symptomatique et/ou préventive de la douleur chez l‟homme. Références (1) Julius, D.; Basbaum, A. I. Molecular mechanisms of nociception. Nature 2001, 413, 203-210. (2) Lory, P.; Monteil, A.; Chemin, J.; Bourinet, E.; Nargeot, J. Du clonage des canaux calciques de type T à l'étude de leurs rôles physiologiques. Médecine / Sciences 2001, 17, 979-988. (3) Matthews, E. A.; Dickenson, A. H. Effects of ethosuximide, a T-type Ca(2+) channel blocker, on dorsal horn neuronal responses in rats. Eur J Pharmacol 2001, 415, 141-149. (4) Dogrul, A.; Gardell, L. R.; Ossipov, M. H.; Tulunay, F. C.; Lai, J. et al. Reversal of experimental neuropathic pain by T-type calcium channel blockers. Pain 2003, 105, 159-168. 104
Courants de type-T (pA/pF) Seuil de douleur (g) Injections antisens (5) Bourinet, E.; Alloui, A.; Monteil, A.; Barrere, C.; Couette, B. et al. Silencing of the Ca V 3.2 T-type calcium channel gene in sensory neurons demonstrates its major role in nociception. Embo J 2005, 24, 315-324. 800 700 600 500 400 300 200 100 Avant ligature Après ligature contrôle 20 ms Douleur mécanique (test de pression de la patte) Courants de type-T à J+4 AS Ca V 3.2 200pA * * * -7 0 4 5 6 7 8 9 10 11 12 (jours) * 10 8 6 4 2 0 * (n=43) (n=53) contrôle AS Ca V 3.2 contrôle AS Ca V 3.2 D’après Bourinet et coll (2005) EMBO J * Figure1: Effet cinétique de l‟injection intrathécale d‟antisens dirigés contre Ca V 3.2 chez les rats neuropathiques. La neuropathie a été induite selon le modèle de Bennett & Xie consistant en des ligatures lâches du nerf sciatique. Deux groupes d‟animaux, rendus neuropathiques par la constriction du nerf sciatique, on été injectés deux fois par jours pendant 4 jours avec 10µl contenant 12.5 µg d‟antisens (triangles) ou d‟une séquence d‟ADN contrôle (cercles). Les seuils de réponses douloureuses à un stimulus mécanique (pression de la patte) ont été enregistrés dans le strict respect des règles d‟étique. Les seuils représentés sur le graphique ont été mesurés avant (J-7) et après (J0) l‟induction de la neuropathie, puis tous les jours après la fin du protocole d‟injection des antisens. Il faut noter que l‟antisens anti-Ca V 3.2 induit un effet antidouleur massif (supérieur à celui obtenu à des doses maximales de morphine sur ce test par ex) qui perdure pendant 5 jours après l‟arrêt du traitement. Des expériences contrôles d‟électrophysiologie montrent qu‟à la fin du traitement à J4 (flèche rouge), les neurones nocicepteurs d‟animaux injectés par les antisens montrent une forte réduction de l‟expression des canaux calciques de type-T contrairement au neurones prélevés sur des animaux traités avec la séquence contrôle (partie encadré). 105
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