SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

aujourd‟hui utilisée en routine pour comprendre comment l‟information olfactive est codée
dans le cerveau.
Protocole 1 : Préparation du cerveau in vivo et imagerie calcique du lobe antennaire
Les abeilles sont anesthésiées par le froid sur de la glace pillée jusqu‟à immobilité, afin de permettre une
manipulation plus aisée. Elles sont ensuite fixées sur un support en plexiglas permettant d‟isoler physiquement la
région céphalique du reste du corps pour les enregistrements d‟imagerie. La tête est maintenue immobile à l‟aide
de cire dentaire fondant à basse température (Deiberit 502, Böhme & Schöps, Allemagne). Grâce à la cire et à de
la colle Epoxy à deux composants (type Araldite), on crée une zone étanche autour du cerveau, laissant les
antennes, organes olfactifs, à l‟air libre, afin de pouvoir leur appliquer des stimulation olfactives. Les pièces
buccales sont fixées à la cire pour éviter tout mouvement de la préparation. Une fenêtre est alors découpée dans
la cuticule de la capsule céphalique, des antennes à l‟avant jusqu‟aux ocelles à l‟arrière, en suivant le contour
délimité par les yeux sur les côtés. Une fois la cuticule retirée, les glandes mandibulaires, les trachées et les
membranes qui recouvrent le cerveau sont retirées délicatement à l‟aide de pinces extra-fines. La zone étanche
réalisée permettra de baigner le cerveau dans du liquide physiologique (Ringer : 130 mM NaCl, 6 mM KCL, 4
mM MgCl 2 , 5 mM CaCl 2 , 160 mM sacchacrose, 25 mM glucose, 10 mM HEPES, pH 6,7). La sonde calcique
utilisée est le Calcium Green 2-AM (Molecular Probes, Oregon, USA). Le groupement acétoxyméthylester (AM)
rend la sonde liposoluble, ce qui permet au colorant de passer à travers les membranes plasmiques et de marquer
ainsi toutes les cellules. Dans le cytoplasme, la sonde devient fonctionnelle après le clivage du groupement AM
par les estérases endogènes. Une dose de 50μg est diluée dans 20 μl de Pluronic F-127 (solution à 20% dans du
DMSO) puis dans 800 μl de Ringer, pour une concentration finale de 33 M. Le marquage se fait en bain, en
déposant 20 μl de cette solution sur le cerveau. L‟incubation est effectuée sur de la glace pendant 1h, après quoi
le cerveau est abondamment rincé à l‟aide de Ringer.
Les expériences d‟imagerie calcique sont réalisées à l‟aide d‟un système d‟imagerie T.I.L.L. photonics
(Gräfelfing, Allemagne) adapté sur un microscope à épifluorescence Olympus BX51WI. Le système d‟imagerie
est composé d‟un monochromateur permettant d‟exciter la préparation avec une longueur d‟onde donnée (bande
d‟environ 15 nm), d‟une caméra refroidie (IMAGO, 12bits), d‟un ordinateur contenant un logiciel d‟acquisition
et d‟exploitation des images (Tillvision). Les enregistrements sont réalisés à l‟aide d‟objectifs 10x et 20x à
immersion à eau (Olympus). La préparation est excitée à 475nm (optimum du colorant in vivo). Un système
contenant un filtre dichroique (à 505nm) et un filtre d‟émission (laissant passer la lumière au-dessus de 515 nm)
permet de récupérer principalement la lumière pertinente, i.e. correspondant à la concentration intracellulaire de
calcium. L‟intensité du signal fluorescent étant relativement faible, il est nécessaire de regrouper plusieurs pixels
entre eux (« binning » horizontal et vertical). Les images sont donc réalisées avec un « binning » de 4 (16 pixels
regroupés), avec 45 à 60 ms d‟exposition et sont capturées à une fréquence de 5 Hz avec une résolution de 12
bits (4095 niveaux de gris). Un enregistrement typique dure 20 sec (100 images), une odeur étant présentée à
l‟abeillependant 1 sec, entre les images 15 et 20.
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