SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

MICROSCOPE TIRF SYSTEME D’IMAGERIE
A ONDES EVANESCENTES
Emmanuelle Beccari
Nikon France, 191, rue du marché Rollay, 94504 Champigny-sur-Marne CEDEX
Principe des ondes évanescentes ou TIRF
Que sont les ondes évanescentes ou Total Internal Reflection Fluorescence (TIRF)?
Le TIRF est un phénomène optique qui se produit lorsque la lumière frappe une interface
entre deux milieux d’indices de réfraction différents. L‟incidence d‟un angle supérieur à
l‟angle critique entraîne une réflexion totale.
Lorsque cette lumière est totalement réfléchie, elle ne se propage pas à travers l‟échantillon,
mais engendre un champ électromagnétique (appelé onde évanescente) qui s‟étend en z.
L‟énergie de ce champ décroît de façon exponentielle et l‟onde évanescente ne peut se
propager au-delà d‟une centaine de nanomètres dans le second milieu. C‟est pourquoi,
uniquement cette portion de l‟échantillon, traversée par l‟onde évanescente, peut être excitée
pour émettre de la fluorescence et donc être observée. C’est l’essence de la microscopie
TIRF.
L‟avantage clé du TIRF est la faible profondeur de pénétration de cette onde évanescente.
Seulement les fluorophores adsorbés, adhérés ou liés à la membrane de l‟échantillon sont
excités pour émettre, créant ainsi une très fine section optique. Inversement, les molécules
dispersées en solution ne seront pas excitées. Il en résulte une fluorescence minimale en
dehors de cette section optique, ce qui autorise un rapport signal/bruit important.
Le système TIRF permet la mesure en temps réel des cinétiques de liaison des molécules à
la surface des membranes. C‟est une technique rapide, non dé-structurante, sensible, qui
convient parfaitement au contrôle des interactions moléculaires. Elle offre la possibilité de
suivre les changements de conformation, d’orientation mais aussi la mobilité latérale des
molécules.
Pourquoi le TIRF est-il utile en fluorescence ?
L‟onde évanescente excitera uniquement les fluorophores situés dans une couche de ~100 nm
adjacente à la lamelle. L‟excitation de cette petite section optique aboutit à une très forte
augmentation du rapport signal/bruit. En résultat de cette augmentation, de très petits signaux,
telles que des molécules uniques fluorescentes peuvent être résolues au-delà du bruit de fond.
SYSTEME D’IMAGERIE D’ONDES EVANESCENTES NIKON
TIRF Double Layer
Grâce à sa technologie optique unique CFI60, Nikon a développé des rehausses permettant
d‟intégrer de nouveaux systèmes d‟excitation. Les objectifs TIRF Nikon de grande ouverture
numérique rendent possible l‟introduction d‟une illumination laser à des angles incidents plus
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