SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

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ou G est la conductance et Eq le potentiel d‟équilibre L‟électrophysiologiste aime représenter son canal favori avec sa courbe courant-potentiel (courbe I- V). Cette relation I-V dérive de la loi d‟Ohm en intégrant d‟une part, la composante électromotrice du courant (I = G (Em – Eq)) et d‟autre part la voltage-dépendance de l‟activation du canal. Ainsi, la courbe I-V d‟un courant calcique a une forme en « V » (voir ci contre) caractéristique indiquant Activation -100 -50 Vm (mV) Cell attached (canal unique) : Inside-out Courbe courant potentiel : 0.5 1 I (nA) le seuil d‟activation et le potentiel d‟inversion Eq du courant. Il est important de noter, toutefois, que la valeur du potentiel d‟inversion (~ +50 mV) reste éloigné du potentiel d‟équilibre théorique pour l‟ion Ca 2+ (~ +130 mV). A ce jour, la raison du décalage entre potentiel d‟inversion et d‟équilibre pour les canaux calciques n‟est pas identifié, ces canaux étant hautement sélectifs pour les ions Ca 2+ . L’ENREGISTREMENT DE COURANTS IONIQUES. L‟activité électrique d‟une cellule excitable au cours du temps dépend des courants ioniques qui modulent, et sont modulés en retour, par le potentiel membranaire. Mesurer ces courants ioniques nécessite un contrôle du potentiel membranaire. On enregistre les courants ioniques en utilisant la technique de voltage imposé (voltage-clamp). Cette approche consiste à utiliser un amplificateur opérationnel pour contrôler en permanence le potentiel de membrane afin d‟enregistrer le courant ionique à l‟état stationnaire. Différentes approches techniques permettent des mesures en voltage imposé : simple microélectrode, double microélectrodes et bien sur le patch-clamp… Certaines techniques permettent d‟enregistrer l‟activité électrique sur des préparations multicellulaires. Je présenterai ici uniquement la technique de patchclamp qui permet la mesure de courants ioniques à l‟échelon de la cellule unique. Le patch-clamp (voir ci contre) est la technique la plus performante pour enregistrer les courants ioniques cellulaires. Elle consiste à coller une pipette de verre (borosilicate, quartz..) sur une cellule. Un gigaseal est obtenu lorsque l‟on atteint l‟étanchéité ionique dans cette configuration : la résistance est de l‟ordre de 10 12 Ω. Cette résistance élevée permet d‟établir un circuit électrique connectant le milieu intracellulaire avec le Whole Cell (cellule entière) Outside-out milieu intra-pipette. La mesure d‟un courant ionique via l‟électrode de la pipette est alors Eq +50 14
possible. Lors de la réalisation du gigaseal, seule la microsurface membranaire délimitée par la pointe de la pipette est électriquement controlée. Cette configuration du patch-clamp est appelée « cell-attached ». Si un canal est présent sur ce « patch » de membrane, le passage d‟ions peut-être détecté : on parle alors de courant unitaire (canal unique ou single channel). Si l‟on casse cette membrane, on permet une continuité électrique entre le milieu intra-pipette et le compartiment intracellulaire (configuration cellule entière ou whole cell) et l‟activité de l‟ensemble des canaux de cette cellule peut être mesurée : on parle de courant macroscopique ( ou whole cell recording). D‟autres configurations peuvent être obtenues par le jeu de suction et de retrait de la pipette : inside-out et outside-out. Ces variantes de la configuration « canal unique » permettent d‟étudier les propriétés biophysique d‟un canal d‟une façon complémentaire : en inside-out, la face intracellulaire du canal est dans la chambre d‟enregistrement ce qui permet d‟étudier les régulations intracellulaires du canal. Ces différentes configurations peuvent donc être utilisées pour enregistrer des courants calciques. Il convient toutefois de respecter certaines règles pour ces enregistrements. En particulier, la composition des milieux intracellulaire et extracellulaire doit être adaptée. Afin de mesurer un courant calcique, il faut s‟affranchir des autres conductances, Na + , et K + en particulier. En configuration cellule entière, la substitution du Na + extracellulaire par du TEA (tetraethylammonium) et la substitution du K + intracellulaire par du Cs + est une possibilité. Des bloqueurs pharmacologiques et toxines peuvent être Activation Mesure du courant calcique : -30 mV 50 pA Inactivation <strong>20</strong> ms -110 mV Déactivation également utilisés. Ceci permet d‟enregistrer un courant entrant (vers le bas) qui est porté par les ions Ca 2+ (voir ci dessus). Les ions Ca 2+ peuvent être substitués par des ions Ba 2+ (Baryum) ou Sr 2+ (Strontium) qui sont aussi perméants pour les canaux calciques. Une analyse biophysique des courants calciques peut alors être effectuée. Aux différentes composantes de ce courant : activation, inactivation, déactivation.. correspondent des changements conformationnels des canaux (Fermé – Ouvert – Inactivés). L‟ensemble des paramètres d‟enregistrement et d‟analyse des canaux sera présenté et discuté lors de la présentation. 15
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