SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

APPLICATION : ETUDE D’UNE VOIE DE SIGNALISATION CALCIQUE DANS LE
FOLLICULE PILEUX HUMAIN AVEC LA SONDE CAMELEON YC6.1
Céline GOHORY
Centre de Biologie du Développement, UMR 5547, Université Paul Sabatier, 118 route de
Narbonne, 31062 Toulouse Cedex 4
Nous avons testé les performances de la sonde caméléon YC6.1 (Truong et al, 2001).
Cette sonde est constituée de deux GFP modifiées (CFP et YFP), et de deux fragments de
calmoduline reliés par le peptide CKKp (CaM – dependent kinase kinase, Osawa et al, 1999).
Cette sonde permet, lorsqu‟elle fixe le calcium un phénomène de FRET (Fluorescence
Resonance Energy Transfer) entre CFP et YFP. Le rapport de fluorescence YFP / CFP permet
de mesurer la concentration intracellulaire en calcium.
La sonde est introduite par transfection. Le protocole de transfection ainsi que la
fonctionnalité de la sonde ont tout d‟abord été testés sur des cellules Hela (lignée cellulaire de
kératinocytes issue d‟un cancer des ovaires humain). La lipofectine (Invitrogen) est utilisée
comme agent transfectant.
Les cellules sont cultivées dans un milieu D - MEM (Milieu de Eagle modifié par
Dulbecco) à forte teneur en glucose (Gibco) supplémenté de facteurs de croissance et
d‟antibiotiques.
Dès que les cellules atteignent un pourcentage de confluence suffisant (de l‟ordre de
70%), elles sont transfectées (4µg d‟ADN) à l‟aide de la lipofectine selon le protocole
Invitrogen. Les mesures peuvent être réalisées 24 heures après la transfection.
Les cellules sont alors transférées dans un milieu non autofluorescent préparé au
laboratoire : le KRH (Krebs Ringer Hepes Buffer) dont la composition est la suivante : KCl
5mM, MgSO 4 1.25 mM, NaCl 125 mM, Hepes 25 mM, Glucose 8 mM, KH 2 PO 4 1.25 mM, et
CaCl 2 1.5 mM. L‟imagerie est réalisée sur un microscope inversé à épifluorescence (Nikon
Eclipse TE2000 – E, objectif à immersion x63 N.A. : 1.4). L‟enregistrement des mouvements
de calcium est effectué grâce à une caméra triCCD et le logiciel Aquacosmos 2.5 (système
Ashura commercialisé par la société Hamamatsu). Une addition de 10 µM d‟histamine dans
le milieu extérieur entraîne une libération de calcium à partir des stocks internes. Dans de
nombreux cas nous observons des oscillations de la concentration en calcium intracellulaire
pouvant durer plus de 10 minutes.
Cette validation nous a permis d‟étudier le rôle prépondérant joué par une voie de
signalisation calcique dans le développement du follicule pileux humain.
A l‟heure actuelle, aucun traitement pour palier la chute de cheveux ne donne entière
satisfaction, il est donc important de comprendre quels sont tous les mécanismes moléculaires
mis en jeu lors du cycle pilaire. Il a été démontré que la protéine noggin, antagoniste des
BMPs joue un rôle dans ce cycle en participant à l‟initiation de la phase de croissance du poil
(Botchkarev et al, 2001). Or, il a été démontré dans notre équipe que noggin était capable
d‟induire une augmentation de calcium intracellulaire dans les cellules de l‟ectoderme lors de
la détermination neurale chez le xénope (Leclerc et al, 1997). Nous avons donc voulu
analyser l‟effet de noggin dans des cellules du follicule pileux humain lors de la phase de
croissance du cheveu (phase anagène).
A partir de biopsies de cuirs chevelus, nous avons effectué des microdissections de
follicules pileux en phase de croissance afin de prélever les principaux tissus qui le composent
pour réaliser des primo – cultures de cellules de plusieurs types :
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