SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

dans l‟utilisation de ces sondes sont à signaler, leur sensibilité vis-à-vis du pH et le repliement
de la cpGFP qui nécessite une température inférieure à 37°C. Très récemment, la protéine
fluorescente sensible au calcium, G-CaMP a toutefois permis de réaliser une cartographie du
cerveau de la mouche Drosophila melanogaster en réponse aux odeurs (Wang et al. 2003).
LES NOUVEAUX CALCIUM SENSORS
Les caméléons à base de CaM posent problème car souvent la CaM interagit avec la
machinerie cellulaire en particulier avec les CaM endogènes rendant la sonde inefficace. Les
troponeons constituent un système plus neutre. La troponine C, (calcium sensor des muscles
squelettiques et cardiaques) remplace la partie CaM. La troponine C se lie avec peu de
proteines endogènes (Heim and Griesbeck 2004).
Les fragments de troponine de muscle squelettique de poulet ou de troponine cardiaque
humaine sont insérés entre la CFP et la citrine ce qui donne des des S-troponeons ou des C-
troponeons. Il n‟y a pas besoin de rajouter le segment M13. La réponse est une réaction FRET
avec une affinité comprise entre 0.5 et 1.2 µM. Il existe un mutant basse affinité de 30 µM.
les troponéons ont une dynamique conservée lorsqu‟ils sont adressés à la membrane à l‟aide
d‟une fusion avec la synaptobrevin alors que les caméléons ont une dynamique diminuée dans
les mêmes conditions. Les troponeons se comportent mieux que les caméléons lorsqu‟ils sont
adressés à des domaines subcellulaires.
D‟autre part, R. Tsien vient de faire une nouvelle sonde en fabricant une calcium binding
molecule n‟interférant pas avec les protéines endogènes. Il replace dans le module CaM, 4
résidus basiques par 4 résidus acides. Ce mutant MLCK permet de réduire 10 000 fois
l‟affinité pour la CaM native. La nouvelle sonde CaM/MLCK a été insérée dans une caméléon
YC3.3, la sonde résultante, appelée D1, répond par FRET de la même manière que la
caméléon. Le FRET n‟est pas affecté par l‟addition de CaM. La dissociation avec le calcium
est accrue. Ces sondes YC peuvent être utilisées en microscopie bi –photonique.
ORGANISMES TRANSGENIQUES
Les premiers succès animaux ont été obtenus chez les invertébrés : la drosophile et
Coenorabditis elegans. Chez les mammifères les résultats sont plus mitigés sans doute en
raison d‟interactions des caméléons avec des protéines endogènes. Par contre on peut faire des
transfections transitoires par électroporation : par exemple, dans le muscle, les caméleons
peuvent rester fonctionnelles pendant 3 semaines.
Des souris transgéniques pour les pericams inverses et les camgaroo ont été réalisées sous
contrôle d‟un promoteur tétracycline. La sonde était exprimée dans le système nerveux. Des
mesures ont pu être faites sur des animaux âgés de 8 à 12 semaines. Les changements in vivo
sont cependant plus faibles que ceux observés sur les cultures de cellules (Hasan et al. 2004).
Chez les plantes, la caméléons sont assez utilisés.
Pensez à consulter Catherine Leclerc et Patrice Thuleau, fascicule 2002, http://wwwcalcium.ups-tlse.fr/atelier/archives.php
Bibliographie
Allen GJ, Murata Y, Chu SP, Nafisi M, Schroeder JI (2002) Hypersensitivity of abscisic acid-induced cytosolic
calcium increases in the Arabidopsis farnesyltransferase mutant era1-2. Plant Cell 14(7): 1649-1662.
Allen GJ, Kwak JM, Chu SP, Llopis J, Tsien RY et al. (1999) Cameleon calcium indicator reports cytoplasmic
calcium dynamics in Arabidopsis guard cells. Plant J 19(6): 735-747.
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