SEIX 17-20 octobre 2005 - Atelier Calcium

Amplitude moyenne (%)
Protocole 3 : Imagerie calcique de neurones du lobe antennaire in vitro
1) Préparation cellulaire : Les abeilles sont anesthésiées par le froid sur de la glace pillée jusqu‟à
immobilité. La cuticule de la capsule céphalique est ouverte et le cerveau découvert comme dans les protocoles
précédents. La cavité céphalique est alors remplie de milieu Leibovitz L15 additionné de saccharose (122,7 mM),
de glucose (22,2 mM), de fructose (13,9 mM), de proline (28,7 mM) et d‟antibiotiques (Pénicilline [200 UI/ml],
Streptomycine [200 g/ml]), le pH étant ajusté à 7,4 avec du NaOH. Etant donné que les somas des cellules du
lobe antennaire se situent à sa base (voir leur position en haut à droite de la Figure 1c), l‟ensemble du lobe est
prélevé sous loupe binoculaire à l‟aide de pinces extrafines. L‟isolement des cellules est ensuite réalisé en
conditions stériles grâce à une digestion enzymatique suivie d‟une dissociation mécanique. Pour cela, les tissus
prélevés sont incubés pendant 30 minutes dans du liquide physiologique contenant un mélange de collagénase
(0,25 mg/ml)/protéase (1 mg/ml) et dépourvu de calcium et de magnésium. La dissociation mécanique est
ensuite réalisée dans du milieu de culture contenant du sérum de veau fœtal (13%) par passages successifs des
tissus digérés à travers des pipettes de diamètres décroissants. Vingt microlitres de suspension cellulaire sont
ensuite délicatement déposés sur une lamelle de verre recouverte d‟un mélange concanavaline A/ laminine.
Après avoir laissé les cellules adhérer, du milieu de culture est ajouté. Les cellules sont alors maintenues dans
une étuve à 26°C en atmosphère humide jusqu‟à leur utilisation lors des expériences d‟imagerie.
2) Imagerie cellulaire : Les expériences sont réalisées avec la sonde calcique Fura2-AM, qui est déposée à
une concentration entre 2 et 5 M (avec pluronic et DMSO – Cf Protocole 1) dans les boîtes de Pétri contenant
les cellules. Grâce au groupement AM, la sonde pénètre dans les cellules pendant l‟incubation, qui dure entre 30
et 75 min. Les expériences sont réalisées avec le même système d‟imagerie que précédemment, avec un objectif
20x à immersion à eau. Les images sont réalisées avec un « binning » de 4 à une fréquence comprise entre 0,5 et
4 Hz. Le temps d‟exposition aux longueurs d‟onde d‟excitation du fura2-AM (340 nm et 380 nm, voir plus haut)
est compris entre 5 et 50 ms. Contrairement aux expériences présentées précédemment, du liquide physiologique
est perfusé en continu (débit réglé à 5 ml/min par une pompe péristaltique) lors de l‟expérience. Le liquide
perfusé est extrait en permanence par une pompe à vide de telle manière que la quantité de liquide dans la
chambre reste constante. Un système de perfusion par gravité permet d‟effectuer les stimulations
pharmacologiques de manière contrôlée, pendant une durée fixe (ici 15 sec).
Grâce à ce protocole d‟imagerie cellulaire, nous avons pu étudier les réponses des cellules du
lobe antennaire à l‟ACh. Ainsi, l‟application d‟ACh à la dose de 10 -5
M entraîne une
augmentation de calcium dans la plupart des cellules en culture [67 % (10/15)] (Figure 4).
a
ACh 10 -4 M
b
115
105
Δ ratio 0,1
1 min
95
90
0
LP ACh 10 -5 M LP ACh 10 -4 M
Figure 4 : Récepteurs cholinergiques des cellules du lobe antennaire. a) Exemples de tracés de l‟évolution du ratio de
fluorescence (Δ ratio) en fonction du temps (min). L‟application d‟ACh (10 -4 M) entraîne une augmentation du calcium
cytoplasmique dans les cellules isolées en culture. b) Représentation en pourcentage de l‟amplitude moyenne des réponses
(± SEM). Suite aux applications d‟ACh 10 -5 et 10 -4 M sur les cellules isolées, les amplitudes des réponses sont
significativement supérieures à celles du liquide physiologique (LP).
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