Sažeci 2. Hrvatskog kongresa medicinske biokemije - Klinički zavod ...

Sažeci 2. Hrvatskog kongresa medicinske biokemije
POSTERSKI RADOVI
RESTRIKCIJSKI POLIMORFIZAM EKSONA 4
HEPATOCITNOG ČIMBENIKA RASTA
I. Žuntar, E. Topić, N. Antoljak
04/P3
Klinički zavod za kemiju Medicinskog fakulteta i KB "Sestre milosrdnice", Zagreb
Hepatocitni čimbenik rasta (HGF) je citokin s mnogobrojnim ulogama.
Sintetiziraju ga razne stanice, a najvećim djelom Ito, Kupferove,
endotelne, fibroblasti i stanice u Peyerovim pločicama. HGF mRNA
dokazana je u gotovo svim tkivima uključujući jetru, bubreg, slezenu,
timus, štitnjaču i placentu. Regulira rast, razvoj, pokretljivost i morfogenezu
stanica. Glavni je čimbenik regeneracije jetre. Također ima
svojstvo angiogeneze in vitro te reguliranja lučenja proteina akutne
faze upale i cc-fetoproteina u kulturi stanica tumora. Izlučuje se u
neaktivnom obliku kao jednolančana molekula od 728 aminokiselina.
Aktivni HGF nastaje proteolitičkim cijepanjem i sastoji se od a (69
kD) i (3 (34 kD) lanca. Učinak HGF ostvaruje se vezanjem na specifični
tirozin-kinazni receptor. Gen za HGF smješten je na kromosomu 7,
lokus qll.l-21 i sastoji se od 18 eksona i 17 introna približne dužine
od 70 kb. HGF sadrži strukturne domene petlje od kojih je svaka
kodirana s dva eksona. Eksoni 4 i 5 kodiraju prvu strukturnu domenu
preko koje se ostvaruje veza s receptorom. Budući da mutacije na
visokokonzerviranim domenama uglavnom vode ka patološkom procesu,
naš cilj bio je ispitati polimorfizam eksona 4 ljudskog HGF. DNA
je izolirana makrometodom iz 70 uzoraka krvi, 40 zdravih dobrovoljaca
i 30 ispitanika s bolešću jetre. Uzorku DNA koncentracija je određena
spektrofotometrijski na osnovu optičke gustoće na 260 nm te ispitana
kvaliteta elektroforezom s gelom uronjenim u pufer (Pharmacia
Biotech) na 0,3%-tnoj MP-agarozi. Ulomak DNA od 214 pb umnožen
je PCR tehnikom na aparatu s pouzdanim profilom grijanja i hlađenja
(Gene E thermal cvcler, Techne). Nakon provjere uspješnosti PCR na
1,5%-tnoj MP-agarozi, umnoženi ulomak od interesa cijepanje restrikcijskim
enzimom Mva I (Boehringer Mannheim) dajući fragmente od
136 i 78 pb. Cijepanje smo provjerili elektroforezom na 3%-tnoj (4%)
NuSieve agarozi (FMC BioProducts) te 12%-tnom (15%) PAG uz odgovarajući
molekularni biljeg (Boehringer Mannheim). Preliminarnim
ispitivanjem pronašli smo optimalne uvjete PCR reakcije i elektroforetske
tehnike otkrivanja za naš ulomak od interesa.
130 BIOCHEMIA MEDICA god. 6, br. 1, 1996