guía práctica de experimentos para - Ecologia e Gestão Ambiental

morfométricos y comportamentales en las
diferencias en los índices de condición, entre
machos y hembras. Pueden sugerirse especies
con una amplia distribución tales como el gobio
(Ej Pomatoschistus), crustáceos (Ej Crango.,
Carcinus maenas), y bivalvos (Ej Cardium)
Los organismos vivos adultos pueden ser de
muestreo (Ej peces y camarones, en rocas o
fango) o comprados en mercados locales (Ej
bivalvos). Todas las muestras deben ser
sometidas a condiciones de estrés cumulativo
en los acuarios durante 3-4 días, Ej hipoxia o
hambre. Los organismos serán congelados o,
preferentemente, colocados en nitrógeno líquido
inmediatamente después de la recolección.
a) Análisis de Laboratorio
Los especímenes de peces, camarones y
bivalvos se observarán, después de
descongelados, usando un microscopio de
disección para identificar el sexo y determinar la
medida de longitud total y el peso seco y
húmedo. Para todos los organismos
macroestructurales deberán ser registradas las
etapas de maduración.
El factor condición se determinará sobre la base
de la fórmula K = W/L 3
, donde W es la masa
corporal (mg) y L es la longitud estándar (mm).
Los contenidos de RNA y DNA pueden ser
analizados de acuerdo a los métodos
fluorimétricos descritos por Esteves et al.
(2000). Los ácidos Nucleicos se extraen de una
porción de tejido de 200 µg en las muestras de
músculo blanco añadiendo 150 µl de sarcosina
al 1% y triturando las muestras en hielo (Figura
1).
Después de agitar y centrifugar, las muestras
son diluidas en una concentración final del 0.1%
usando hielo frío Tris buffer. La fluorescencia se
mide fotométricamente usando bromuro de
etidio . La cantidad de fluorescencia originada de
RNA (principalmente RNA ribosomal) se calcula
como la diferencia entre la fluorescencia total
(RNA y DNA) y la fluorescencia después del
tratamiento de ribonucleasa A (tipo II-A), que se
supone que deriva de DNA. La fluorescencia se
determina por excitación a 365 nm y detección a
590 nm usando un espectrofluorímetro (Foto 1).
Las concentraciones de las muestra de ácidos
nucleicos se determinarán a partir de curvas
estándar realizadas diariamente usando el DNA
lambda y el RNA ribosomal de concentración
conocida y gama adecuada.
GUÍA PRÁCTICA DE EXPERIMENTOS PARA ECOHIDROLOGÍA 100
Foto 1. Determinación de la Fluorescencia con el
uso de un espectrofluorímetro.
Larva (> 200 ug peso en seco)
Sedimento
(otolitos + proteinas)
0.15 ml 1% sarosina
Vortex, 2 min.
15 min. a temperature ambiente
Vortex, 2 min.
15 min. a temperature ambiente
1.35 ml Tris-EDTA buffer
Sacudida
Centrífuga 5 min. at 4930 rpm
(DNA+RNA)
0.2 ml
0.4 ml Tris-Base
+
0.05 ml EB
Flotante
Para más análisis
Flotante
(RNA)
0.2 ml
0.35 ml Tris-Base
+
0.05 ml RNase
Incubación at 37ºC
Durante 30 min.
> 15 min. a
Temperature ambiente
Dejar enfriar
+
0.05 ml EB
Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de
extracción de sarcosina y la metodología de
cuantificación de ácidos nucleicos descrita por
Esteves et al. (2000).
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