guía práctica de experimentos para - Ecologia e Gestão Ambiental

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morfométricos y comportamentales en las diferencias en los índices de condición, entre machos y hembras. Pueden sugerirse especies con una amplia distribución tales como el gobio (Ej Pomatoschistus), crustáceos (Ej Crango., Carcinus maenas), y bivalvos (Ej Cardium) Los organismos vivos adultos pueden ser de muestreo (Ej peces y camarones, en rocas o fango) o comprados en mercados locales (Ej bivalvos). Todas las muestras deben ser sometidas a condiciones de estrés cumulativo en los acuarios durante 3-4 días, Ej hipoxia o hambre. Los organismos serán congelados o, preferentemente, colocados en nitrógeno líquido inmediatamente después de la recolección. a) Análisis de Laboratorio Los especímenes de peces, camarones y bivalvos se observarán, después de descongelados, usando un microscopio de disección para identificar el sexo y determinar la medida de longitud total y el peso seco y húmedo. Para todos los organismos macroestructurales deberán ser registradas las etapas de maduración. El factor condición se determinará sobre la base de la fórmula K = W/L 3 , donde W es la masa corporal (mg) y L es la longitud estándar (mm). Los contenidos de RNA y DNA pueden ser analizados de acuerdo a los métodos fluorimétricos descritos por Esteves et al. (2000). Los ácidos Nucleicos se extraen de una porción de tejido de 200 µg en las muestras de músculo blanco añadiendo 150 µl de sarcosina al 1% y triturando las muestras en hielo (Figura 1). Después de agitar y centrifugar, las muestras son diluidas en una concentración final del 0.1% usando hielo frío Tris buffer. La fluorescencia se mide fotométricamente usando bromuro de etidio . La cantidad de fluorescencia originada de RNA (principalmente RNA ribosomal) se calcula como la diferencia entre la fluorescencia total (RNA y DNA) y la fluorescencia después del tratamiento de ribonucleasa A (tipo II-A), que se supone que deriva de DNA. La fluorescencia se determina por excitación a 365 nm y detección a 590 nm usando un espectrofluorímetro (Foto 1). Las concentraciones de las muestra de ácidos nucleicos se determinarán a partir de curvas estándar realizadas diariamente usando el DNA lambda y el RNA ribosomal de concentración conocida y gama adecuada. GUÍA PRÁCTICA DE EXPERIMENTOS PARA ECOHIDROLOGÍA 100 Foto 1. Determinación de la Fluorescencia con el uso de un espectrofluorímetro. Larva (> 200 ug peso en seco) Sedimento (otolitos + proteinas) 0.15 ml 1% sarosina Vortex, 2 min. 15 min. a temperature ambiente Vortex, 2 min. 15 min. a temperature ambiente 1.35 ml Tris-EDTA buffer Sacudida Centrífuga 5 min. at 4930 rpm (DNA+RNA) 0.2 ml 0.4 ml Tris-Base + 0.05 ml EB Flotante Para más análisis Flotante (RNA) 0.2 ml 0.35 ml Tris-Base + 0.05 ml RNase Incubación at 37ºC Durante 30 min. > 15 min. a Temperature ambiente Dejar enfriar + 0.05 ml EB Figura 1. Diagrama de flujo del procedimiento de extracción de sarcosina y la metodología de cuantificación de ácidos nucleicos descrita por Esteves et al. (2000). 100
3. Material y equipamiento a) Colecta de campo Serán necesarios materiales y equipamiento para colecta de agua, peces, camarones y bivalvos: • Cestos y envases para colecta y transporte de agua al laboratorio; • Pequeño equipo para draga manual para muestreo de bivalvos, crustáceos y peces de estanques; • Vestuario: botas de agua para caminar por las márgenes, chaqueta a prueba de agua. b) Experimentos de laboratorio • Pinzas; • Microscopio y microscopio de disección; • Horno y mufla para la determinación del AFDW de los organismos (peso seco sin cenizas); • Fluorímetro; • Centrífuga; • Baño; • Pipetas automáticas. c) Análisis de los datos • Ordenador; • Hoja de datos. 4. Organización de los datos Análisis estadístico básico Para el índice morfométrico sera necesario organizer los datos de acuerdo con los ejemplos en la table 1. Tabla 1. Índice morfométrico determinado en Carcinus maenas Wet weigth (mg) Total length (mm) Sex Weigth/Length 3 2120 16,72 Female 0,45 3580 19,37 Female 0,49 4050 19,48 Female 0,55 4510 20,84 Female 0,50 5780 22,38 Female 0,52 6050 24,93 Female 0,39 6570 23,52 Female 0,50 6880 23,97 Female 0,50 7350 25,72 Female 0,43 3630 19,86 Male 0,46 3650 19,87 Male 0,47 6020 23,63 Male 0,46 8700 26,27 Male 0,48 10450 29,4 Male 0,41 11990 28,36 Male 0,53 13600 31,03 Male 0,46 17700 31,72 Male 0,55 GUÍA PRÁCTICA DE EXPERIMENTOS PARA ECOHIDROLOGÍA 101 Será necesario realizar un análisis de regresión entre las unidades de fluorescencia y las concentraciones de ácidos nucleicos (véase Figura 2). Flu Flu 2000 1500 1000 500 2000 1500 1000 500 RNA calibration y = 300,58x + 683,45 R 2 = 0,9882 0 0,00 1,00 2,00 3,00 4,00 5,00 ug/ul DNA calibration y = 991,54x + 703,8 R 2 = 0,9843 0 0,00 0,20 0,40 0,60 0,80 1,00 1,20 ug/ml Figura 2. Relaciones entre las concentraciones standard de ácidos nucleicos y las lecturas de fluorescencia relativa Para analizar las diferencias por razón de sexo en los Índices de condición será necesario realizar el test T- student (p
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INTRODUCCIÓN GUÍA PRÁCTICA DE EX
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ÍNDICE GUÍA PRÁCTICA DE EXPERIME
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descarga (Q) a través de este part
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la dilución de contaminantes trans
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2. DESNITRIFICACIÓN COMO ELEMENTO
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3. Materiales y equipo a) Equipo de
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Ajuste de la proporción N/P: De ac
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c) Análisis de Datos • ordenador
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