Quantitative Analyse von Arzneistoff-Membran-Wechselwirkungen ...

Untersuchungen zu intermolekularen Wechselwirkungen in Membranen
5.3.2 Das EXSY-Verfahren zur Analyse von Permeationsprozessen
5.3.2.1 Auswahl von optimierten Versuchsbedingungen
Die NMR-Spektroskopie kann zur Analyse des Membranaustauschs von Molekülen und damit verbundenen
Transportphänomenen umfassend angewendet werden. Dazu müssen bei einer Verwendung
von Erythrocyten (RBC) die klinischen Parameter wie Hk, MCV und die mittlere RBC-Membranfläche
unter Versuchsbedingungen bekannt sein, die oft um einen Mittelwert innerhalb festgelegter
Grenzen schwanken (Sha´afi et al. 1967; Thews et al. 1999). Nach Erhöhung der Osmolarität der
äußeren Phase um 46 mM NaCl blieb das MCV konstant (Abschnitt 5.1.2.2). Eine Änderung der
Größe eines Erythrozyten wurde nicht nachgewiesen, so dass man ebenso von der Beibehaltung der
Membranfläche ausgehen kann.
Die Validierung des Testsystems erfolgte über Modifizierungen der Zusammensetzung der RBC-
Suspensionen und der Parameter der NMR-Experimente. Die einzelnen Ergebnisse sind in der Tab. 18
aufgelistet. Bei einer TFAm-Konzentration von 1.25 mM lag in jedem Einzelspektrum ein deutliches
Signalpaar mit einem guten S/N-Verhältnis vor. Bei geringeren TFAm-Konzentrationen führte die
unklare Trennung von Signal- zu Nichtsignalbereichen nach der Signalintegration zu Lösungen der
Gl. 16 aus dem Bereich der komplexen Zahlen. Die experimentell bestimmte T1-Zeit von TFAm ohne
RBC im 19 F-NMR-Spektrum betrug 4.13 s. Deren Vierfaches entspricht der Pausenzeit D1 zwischen
jeder Pulsfolge von 15 s, die einen Kompromiss zwischen einer angestrebten vollständigen Spinrelaxation
und einer schnellen Versuchsdurchführung darstellt. Die Beträge für die charakteristischen
Konstanten der Geschwindigkeit des Eintritts k 1 und des Austritts k -1 von TFAm sind aus der
Ergebnismatrix (Gl. 16) direkt entnehmbar. Das Verhältnis Fk aus den Geschwindigkeitskonstanten,
k 1 : k -1 , gilt als Richtungsvektor für die TFAm-Verteilung bzw. -Anreicherung. Aus den anderen
Ausgabewerten (A) und (B) (Abschnitt 9.4) können fiktive Relaxationszeiten für die dazugehörigen
Spezies berechnet werden: aus (A) die T1-Zeit der extrazellulären und aus (B) die T1-Zeit der
intrazellulären Fluor-Kerne.
1
(A) = − ex + k Gl. 21a
T -1
1
1
(B) = − + k Gl. 21b
in 1
T
1
Diese theoretischen longitudinalen Relaxationszeiten dienen als Qualitätsparameter zur Einschätzung
ex
der berechneten Geschwindigkeitskonstanten. Die nach Gl. 21a berechnete T1 -Zeit sollte der
experimentellen T1-Zeit von TFAm ohne RBC von 4.13 s ähnlich sein.
Im gewählten RBC-System wurden gleiche T1-Zeiten (inversion recovery-Methode) der extra- und
intrazellulär vorliegenden Kerne gemessen; sie betragen 2.05 s. Jedoch muss die Relaxationszeit der
extrazellulären TFAm-Moleküle unverändert bleiben, da sie sich ausschließlich in einer wässrigen
Umgebung befinden. Die identischen T1-Werte sprechen für einen schnellen transmembranären
ex in
Austausch der TFAm-Moleküle und stellen den Mittelwert aus T1 - und T1 -Zeit dar. Es ist zu
erwarten, dass die Fluor-Kerne der innerhalb der RBC vorliegenden Moleküle durch die stärkere
in
Einbindung in Wasserstoffbrücken schneller relaxieren, die T1 -Zeit ist in jedem Fall geringer als die
ex
-Zeit einzuschätzen.
T 1
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