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CAPÍTULO V: C.A. ANDALUCÍA
Al analizar el resultado de la digestión de los plásmidos mediante
electroforesis, se observan diferentes patrones de bandas en los distintos clones.
Inicialmente se eligen los clones 37 y 31 para ser secuenciados, como representantes
de los diferentes patrones de bandas observados. En ambos casos, la secuencia del
extremo 18S presentó homología con el extremo 5´ del gen 18S de Marteilia
refringens, el 100% en el caso del clon 37 y el 98% en el caso del clon 31. La
secuencia del extremo 28S presenta homología con secuencias de genes 28S de
diversos organismos.
A partir de la región del IGS secuenciada más próxima al gen 18S de
Marteilia, se diseña un primer interno, IN-1, para continuar secuenciando el
espaciador intergénico. Para la obtención de la secuencia completa, ha sido
necesario diseñar otros dos primers internos, IN-2 e IN-3, a partir de la secuencia de
ADN que se va conociendo.
A excepción de los extremos, el resto de la secuencia no presenta homología
con ninguna secuencia depositada en las bases de datos.
La secuencia completa del IGS de Marteilia refringens se está completando
en estos momentos para enviar a las bases de datos internacionales.
• Determinación de la especificidad del IGS de Marteilia refringens
mediante Southern-blot.
La señal de hibridación aparece solamente en los ADNs de Marteilia
refringens y no en los de ostra, lo cual confirma que se trata de una secuencia
específica del parásito.
• Diagnóstico molecular de Marteilia refringens mediante
amplificación de un fragmento de ADN parásito.
A partir de la secuencia determinada de ADN del IGS de Marteilia, se han
diseñado unos primers, MT-1 y MT-2, para comenzar a realizar ensayos de
diagnóstico molecular de Marteilia refringens a partir de muestras de ADN de Marteilia
y muestras de ADN de glándula digestiva de ostra infectada de parásito.
Se lleva a cabo un experimento de PCR en el que se amplifican muestras de
ADN con primers SAS1 y SS2 del gen 18S de Marteilia refringens diseñados por Le
Roux y con los primers MT-1 y MT-2. Los resultados son los siguientes:
- La cantidad de ADN amplificada por PCR con los primers MT-1 y MT-2
es mucho mayor que la amplificada con los primers SAS1 y SS2, lo que
indica una mayor especificidad de los primeros primers a partir de la
secuencia de IGS de Marteilia refringens.
- Existe una alta sensibilidad de los primers MT-1 y MT-2 para detectar
cantidades ínfimas de ADN de Marteilia refringens. Esta sensibilidad
podría ser incluso mayor, debido a que no todo es ADN puro de Marteilia
refringens, sino que hay contaminación con ADN de esperma de ostra.
Para determinar el límite de detección de los primers a partir de tejido, se
realiza el siguiente experimento. Se mezcla ADN de músculo abductor de ostras
sanas con cantidades decrecientes de ADN de Marteilia refringens purificada a partir
de esporontes. Con estas muestras se lleva a cabo una PCR con los primers
SAS1/SS2 y con los primers MT-1/MT-2. Los resultados son los siguientes:
DESARROLLO DE UN MÉTODO DE DIAGNÓSTICO MOLECULAR PARA M. REFRINGENS
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