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autoradiografia, determina una strisciata continua o un profilo di ibridazione troppo
complesso per essere utilizzato nell’analisi genetica.
La tecnica si articola nelle seguenti fasi:
1. digestione del DNA genomico con enzimi di restrizione (in genere si utilizza un 6-base
cutter come EcoRI). Individui geneticamente diversi per la localizzazione dei siti di taglio
produrranno frammenti di lunghezza diversa;
2. Separazione dei frammenti in base al loro peso molecolare mediante corsa elettroforetica su
gel di agarosio. Successivamente viene eseguito il Southern blotting attraverso il quale è
possibile trasferire, mediante un tampone alcalino (denaturante), i frammenti dal gel di
agarosio su un supporto più stabile quale una membrana di nitrocellulosa o nylon sfruttando
un campo elettrico, un flusso ionico o il vuoto.
3. i frammenti denaturati vengono poi esposti ad una “sonda” (una sequenza di DNA a
singolo filamento) marcata con un isotopo radioattivo (generalmente 32 P o 33 P) o sostanze
fluorescenti (digossigenina o fluoresceina) al fine di individuare solo quei frammenti che
contengono le sequenze complementari a quella della sonda utilizzata.
4. infine la membrana viene esposta su una lastra fotografica. Gli RFLP sono visibili sulla
lastra come bande dovute all’emissione de radioattività (nel caso del 32 P), fluorescenza o
saggio colorimetrico (anticorpi specifici per la digossigenina).
Se compaiono bande diversi tra DNA di individui diversi, significa che la sonda ha trovato
frammenti di diversa lunghezza coi quali appaiarsi. Quindi una sonda e l’enzima utilizzato per
il taglio costituiscono, nel complesso, un marcatore genetico unico, l’RFLP, primo marcatore
molecolare noto.
3.3.1.2 VNTR (Variable Number of Tandem Repeats)
Il genoma delle piante, cosi come quello di molti altri organismi, include molte sequenze di
DNA ripetute (fuori dalle regioni codificanti) probabilmente dovute a fenomeni di
duplicazione e ricombinazione. Le sequenze ripetute, in base alle loro caratteristiche, possono
essere raggruppate in diversi classi. Quando ogni ripetizione è un oligonucleotide di
lunghezza variabile tra 10 e 60 paia di basi (bp) si parla di sequenze “minisatelliti”
(minisatelliti DNA) (Jeffreys et al., 1985). In un dato locus il numero di sequenze ripetute ,
cosi come il motivo base, può variare. Dunque, il taglio del DNA in vicinanza di queste
sequenze ripetute in tandem (tandem repeats) porta a frammenti di restrizione che mostrano
corrispondenti variazioni di lunghezza. Se come sonde si utilizzano sequenze di elementi
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