universita' degli studi della tuscia facolta' di agraria ... - Unitus DSpace

- la fase acquosa superiore è stata trasferita in un nuovo tubo e sono stati aggiunti 800µl di
isopropanolo freddo, mescolando le soluzioni ed incubando a -20°C per due ore.
- Dopo una centrifugazione a 4°C di 20 min a 10000 rpm il pellet precipitato è stato
sottoposto ad un lavaggio con 100 µl di isopropanolo freddo (70%), lasciato asciugare
all’aria e risospeso accuratamente in 500µl di tampone TE (10mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM
EDTA);
- i campioni sono stati incubati 60 min, a 37°C, in presenza di 1µl di 10mg/ml di DNase-free
RNase e, successivamente, miscelati con un volume di fenolo:cloroformio:alcol isoamilico
(25:24:1 v:v:v) e centrifugati a 10000 rpm per 10 min.
- a seguito del trasferimento del surnatante in un nuovo tubo eppendorf, i residui di fenolo
sono stati rimossi mediante l’aggiunta 500µl di un volume di cloroformio:alcol isoamilico
(24:1 v:v) ed il DNA presente nella fase acquosa è stato recuperato dopo centrifugazione a
1000 rpm per 10 min.
- Il DNA è stato infine precipitato con l’aggiunta di 500µl di etanolo freddo e posto a -20°C
per 30 min. Dopo una centrifugazione di 20 min a 1000 rpm a 4°C, il pellet precipitato è stato
sottoposto a uno o più lavaggi mediante 100µl di etanolo freddo 70 %, lasciato asciugare
all’aria e risospeso in 50 µl di tampone TE (10mM Tris HCl pH 8,0, 1 mM EDTA).
Il DNA estratto è stato quantificato su gel d’agarosio e con spetrofotometro, a partire dal
DNA ottenuto di ciascuna delle 90 piante è stata effettuata una caratterizzazione molecolare
mediante applicazione di marcatori AFLP e ISSR.
2.3 Analisi AFLP
L’analisi AFLP è stata condotta su DNA genomico digerito con enzimi MseI e PstI e ligato
con adattatori specifici per i due enzimi utilizzati. Nella preamplificazione (prevista dal
protocollo AFLP) sono stati utilizzati primer con zero basi selettive (Pst0 e Mse0), mentre
nell’amplificazione sono stati utilizzate tre combinazioni di primer con 2 basi selettive:
MseAC-PstCT, MseTT-PstCA, e MseGC-PstAC.
Il protocollo si è articolato nelle seguenti fasi:
- Preparazione del DNA stampo
- Preamplificazione
- Amplificazione selettiva
- Elettroforesi
-Visualizzazione degli amplificati
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