universita' degli studi della tuscia facolta' di agraria ... - Unitus DSpace

Ai fini della caratterizzazione molecolare è stato scelto il primo incrocio, Grato I x MS 9, per
avere un maggior numero di piante (100) sono state collezionate, prelevando porzioni delle
foglie più giovani (10 g) e conservandole in azoto liquido. Le piante campionate sono state
identificate con una sigla progressiva da 1 a 119 rispettando la loro posizione in campo.
2.5 Estrazione del DNA
L’estrazione del DNA per ciascun genotipo, è stata effettuata con il DNeasy Plant Mini Kit
della QIAGEN. Direttamente in un tubo eppendorf da 2,0 ml. è stata omogenizata in azoto
liquido una quantità di tessuto fresco variabile da 0,1 a 0,2 g; il materiale omogeneo ottenuto
realizzando la macinazione con il Tissulyser è lavorato con i buffer del kit. La resa di DNA
ottenuta è stata soddisfacente e di buona qualità.
Il DNA estratto è stato quantificato su gel d’agarosio e con spetrofotometro, a partire dal
DNA ottenuto di ciascuna delle 100 piante è stata effettuata una caratterizzazione molecolare
mediante applicazione di marcatori AFLP e ISSR.
2.6 Analisi ISSR
L’analisi ISSR è stata condotta sulla popolazione scelta, secondo il protocollo già riportato nel
capitolo III paragrafo 2.4. Sono stati utilizzati i primer riportati nella tabella 17 (British
Columbia University).
Tabella 17. Sequenze dei primers ISSR e temperature di annealing (Ta) utilizzate per le
reazioni PCR.
Primer Sequenze 3' →5' Ta (°C)
810 (GA)8T 43
811 (GA)8C 43
812 (GA)8A 44
818 (CA)8G 52
834 (AG)8YT 45
841 (GA)8YC 45
847 (CA)8RC 54
848 (CA)8RG 56
855 (AC)8YT 52
857 (AC)8YG 54
Y= pirimidine; R=purine.
99