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Il protocollo utilizzato per l’analisi ISSR è consistito in tre tappe successive: - amplificazione -.separazione degli amplificati mediante elettroforesi - analisi dei pattern elettroforetici 2.4.1 Amplificazione Le reazioni PCR sono state condotte in volumi finali di 10 µl contenenti 10 ng di DNA genomico, 0,3 µm primer, 100µm di ciascun deossinucleotide (dATP, dCTP, dGTP e dDTP), 10mM Tris-HCl (pH 9,0) e 1 unità di Taq Polimerasi. Le amplificazioni sono state effettuate per mezzo di un termociclatore Eppendorf programmato con il seguente profilo termico: 5 min a 94°C (denaturazione iniziale) 1 min a 94°C (denaturazione) 1 min alla T° di annealing specifica del primer 35 cicli 2 min a 72°C (estensione) 5 min a 72°C (estensione finale). I prodotti di amplificazioni sono stati conservati a 4°C fino al momento della separazione elettroforetica. 2.4.2 Elettroforesi L’elettroforesi è stata condotta secondo il protocollo riportato nel paragrafo 2.3.3. 2.5 Analisi statistica I risultati delle reazioni di amplificazione sono stati separati mediante gel di acrilammide (6%) analizzato con il Genomix della Beckman Coulter. Dai profili di amplificazione sono state analizzate 191 bande per i marcatori AFLP e 51 per gli ISSR da cui si è ottenuta una matrice 0 e 1, attribuendo 0 all’assenza ed 1 alla presenza della banda. La matrice ottenuta è stata utilizzata nella sua totalità, considerando solo i marcatori AFLP o considerando solo i marcatori ISSR per le analisi statistiche, applicando il software GDA 88
(Lewis e Zaykin, 1996). Si è così ottenuta la stima della variabilità genetica fra ed entro popolazioni, il livello di eterozigosità attesa e le distanze genetiche (Nei, 1972) fra le popolazioni da cui poi si sono ottenuti i dendrogrammi (Fig. 1) di similarità genetica usando la metodologia UPGMA. 3. RISULTATI E DISCUSSIONI Come atteso, i materiali analizzati hanno presentato un elevato grado di polimorfismo, evidenziando la potenziale capacità degli AFLP nell’accertamento dei requisiti richiesti alle cultivar nella costituzione varietale (Tab. 13). I risultati hanno mostrato la presenza di una elevata percentuale di variabilità all’interno di ogni popolazione, con valori compresi tra 73% e 85% in funzione del marcatore usato (Tab. 13), mentre la variabilità fra piante di aziende diverse è compresa tra il 27 e il 15% del totale. Questi dati sono in accordo con quelli riportati da altri autori (Lanteri et al., 2001) utilizzando i marcatori RAPD. La percentuale di loci polimorfici è stata calcolata assumendo che il livello massimo per definire un locus polimorfico fosse pari al 95% (criterio di polimorfismo). In questo modo sono stati ottenuti valori del 67% per gli AFLP e dell’80% per gli ISSR; considerando entrambi i marcatori insieme è stato evidenziato un livello di polimorfismo pari al 77%. Valori più bassi sono stati ottenuti utilizzando marcatori di tipo diverso (Lanteri et al., 2001, Sonnante et al., 2002). Analizzando le singole aziende si evidenzia un polimorfismo più alto nell’azienda ‘Latina 2’ e più basso in ‘Latina 1’ con gli AFLP mentre è più alto in ‘Latina 1’ e più basso in ‘Latina 3’ con i marcatori ISSR (Tab. 14). Tali differenze possono essere da imputare al fatto che i due tipi di marcatore rivelano differenti regioni genomiche con diverse similarità e/o a differenze tra i genotipi considerati. 89
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