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2.3.1 Preparazione del DNA stampo
La reazione di restrizione e ligazione sono state effettuate contemporaneamente incubando
250 ng di DNA genomico (5 µl) a 37°C per 4 h in un volume finale di 25 µl costituito da
tampone di restrizione e legazione (R/L) 1X, 2,5 U di MseI, 2,5 U di PstI, 1 U T4 DNA-ligasi,
5 pmol di adattatore PstI, 50 pmol di adattatore MseI e 0,5 mM ATP. Gli adattatori sono stati
preparati miscelando quantità equimolari dei singoli oligonucleotici.
Un’aliquota di 5 µl di DNA ristretto/ligato è stata utilizzata nella successiva fase di
preamplificazione.
2.3.2 Preamplificazione
5 µl di DNA ristretto/ligato sono stati preamplificati in un volume finale di 45 µl, sono stati
utilizzati 75 ng di ogni primer con zero basi selettive (Pst0 e Mse0),tampone PCR 1X, 200 µl
di ciascun dNTP, e 1 U di Taq Polimerasi.
Per le reazioni di preamplificazione è stato utilizzato il seguente profilo termico:
1 min a 94°C (denaturazione iniziale)
- 30 s a 94°C (denaturazione)
- 30 s a 55°C (appaiamento) 25 cicli
- 1 min a 72°C (estensione)
10 min a 72°C (estensione finale).
Prima di eseguire la successiva amplificazione selettiva è stata verificata, mediante
elettroforesi su gel di agarosio al 2 %, la presenza di uno smear di frammenti di peso
molecolare compreso tra un minimo di 100 ed un massimo di 1000 bp. Un’aliquota di DNA
stampo preamplificato è stata diluita 1/10 in dH2O.
2.3.3 Amplificazione selettiva
Come stampo nella amplificazione selettiva sono stati utilizzati 2,5 µl del prodotto di
preamplificazione. In tale reazione, operativamente identica a quella precedente , sono stati
utilizzati primer con 2 basi selettive. Per le reazioni è stato utilizzato il seguente profilo
termico:
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