universita' degli studi della tuscia facolta' di agraria ... - Unitus DSpace

1 min a 94°C (denaturazione iniziale)
30 s a 94°C (denaturazione)
da 65°C a 56.6°C (-0.7 °C ogni ciclo) per 30 s (appaiamento)…….13 cicli
1 min a 72°C (estensione)
5 min a 72°C (estensione finale)
30 s a 56°C (appaiamento
1 min a 72°C (estensione)…….23 cicli
1 min a 72°C (estensione finale)
Al termine dell’amplificazione, i prodotti di reazione sono stati miscelati con 8 µl di loading
buffer (98% formamide, 10 mM EDTA, 0,01% blu di bromofenolo e 0,01% di cilene cianolo)
e conservati a 4°C.
2.3.3 Elettroforesi
L’elettroforesi è stata effettuata con il Genomix della Beckman Coulter, mediante gel di
acrilammide (6%) verticale , preparato tra due lastre di vetro 30 x 60 cm e spaziatori di 0,4
mm. Per la preparazione dei gel denaturanti di poliacrilammide si è utilizzata una acrilammide
premiscelata ad elevata risoluzione per alti pesi molecolari. L’elettroforesi è stata condotta a
80 W per circa 2 h.
2.4 Analisi ISSR
Per i marcatori ISSR sono stati utilizzati i primer 841 e 856 (British Columbia University).
Per ciascuno dei primer testati sono state individuate le condizioni ottimali di amplificazione
PCR (Tab. 12).
Tabella 12. Sequenze dei primers ISSR e temperature di annealing (Ta) utilizzate per le
reazioni PCR.
Primer Sequenze 3' →5' Ta (°C)
841 (GA)8YC 45
856 (AC)8YA 50
Y= pirimidine.
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