PhD Thesis_ver3.pdf

Сравнително in vitro изследване на нови възможности за фармакологично повлияване на
мултипления миелом
4. Четиридесет и осем часа след началото, средата в биореактора се опреснява като
се изтеглят 5 ml от нея и се заместват със същия обем прясна хранителна среда.
5. На 72-ия час от началото напълно се изтегля наличната в биореактора среда, като
се внимава да не се изтеглят и сфероидите от клетки. Биореакторът се запълва с 10-11
ml прясна хранителна среда или суспензия от миеломни клетки в хранителна среда
(0,03.10 6 кл./ml).
6. На 120-ия час от началото култивирането приключва. Сфероидите от клетки се
изваждат от биореактора и се подлагат на имунохистохимичен анализ (т. 2.8.).
2.2. Изолиране на мононуклеарни клетки чрез градиентно
центрофугиране
Беше използван методът на центрофугиране в плътностен градиент, при което клет-
ките се разделят на фракции в зависимост от теглото и формата си.
Изолирането на мононуклеарни клетки от костно-мозъчен аспират от пациенти с
ММ беше извършвано съгласно следния протокол:
1. В две стерилни 15-милилитрови центрофужни епруветки се отпипетират по 5 ml
Ficoll-PaqueTM PLUS.
2. Три милилитра костно-мозъчен аспират се смесват със 6 ml фосфатен буфер. По
4,5 ml от получената смес се наслояват много бавно върху петте милилитра Ficoll-Pa-
que. За целта е най-удобно да се използва спринцовка с подходяща игла.
3. Епруветките се центрофугират 30 минути при 400 × g (1 750 об./мин с ротор
220.97 на Hermle).
4. Получените бели пръстени от мононуклеарни клетки (фиг. III.3.) се засмукват
внимателно с пипета и се прехвърлят в нова епруветка. Разреждат се с фосфатен буфер
в съотношение 1:3.
11).
5. Изолираните мононуклеарни клетки се преброяват с камера на Neubauer.
6. Клетките се центрофугират 10 минути при 150 × g (1 500 об./мин с ротор F-45-12-
7. Надстоящата течност се изтегля, а клетките се ресуспендират в нужното количест-
во хранителна среда.
За изолиране на мононуклеарни клетки от кръв от умбиликална вена беше използван
същият протокол с модификация в стъпка 2. – бяха смесвани 4,5 ml кръв с 4,5 ml
фосфатен буфер. Така бяха изолирани клетки от предоставена кръв от три раждания.
100