PhD Thesis_ver3.pdf

More documents

Recommendations

Info

Сравнително in vitro изследване на нови възможности за фармакологично повлияване на мултипления миелом чество съдържащо 1 µg ДНК, което след това се разрежда с вода до обем 10 µl и се сме- сва с 2 μl 6× оцветяващ разтвор. Всяка смес се нанася в съответен джоб на гела. 3. Смесват се 4 μl двойно дестилирана вода, 1 μl маркер GeneRuler 1 kb DNA Ladder и 1 μl 6× оцветяващ разтвор. Сместа се нанася в един от свободните джобове. 4. Електрофорезната камера се свързва към трансформатора. Необходимото напре- жение във волтове се пресмята като дължината на гела в сантиметри се умножи по 5. 5. Електрофорезата се провежда при изчисленото напрежение за около 1,5-2 часа. 6. Следва се процедурата, описана в т. 2.11.3., стъпки от 8. до 10. 2.17. Въвеждане на чужд генетичен материал в еукариотни клетки Бяха използвани два различни способа за въвеждане на чужд генетичен материал в туморните клетки – трансфекция и трансдукция. Гените за остеопонтин бяха въвеждани с посредничеството на плазмиден вектор. Трансфекцията на туморните клетки с плаз- миди (затворени или линеаризирани) беше осъществявана с помощта на химични аген- ти, подпомагащи процеса. Оптимизацията на процеса и контролът върху ефективността му бяха осъществявани чрез трансфектиране на прицелните клетки с контролен флуо- ресциращ олигонуклеотид. Бяха сравнени качествата на два различни трансфектиращи реагента, единият представляващ катионен полимер (TurboFect), а другият смес от катионни липиди, образуващи липозоми (Lipofectamine 2000). Генът за интерфери- раща РНК, насочена срещу иРНК за човешки Bcl-XL, както и съответните контролни гени (за зелено-флуоресциращия протеин copGFP и за РНК-секвенция, която не предиз- виква специфично разграждане на никоя известна иРНК), бяха въвеждани в клетките с посредничеството на лентивируси. Наличието в плазмидите и вирусните частици на ге- ни, обуславящи резистентност към различни антибиотици, позволи да се проведе селек- ция на клетки, характеризиращи се с трайно интегриране и експресия на чуждия гене- тичен материал в техния геном. Отделните процедури бяха провеждани съблюдавайки следните протоколи: 146
2.17.1. Трансфекция с помощта на Lipofectamine 2000 147 III. Материали и методи – Методи Посочените по-долу количества важат при използване на 24-ямкови плаки. При про- веждане на трансфекция в 12-ямкови плаки се взимат двойно по-големи количества. 1. Приготвя се клетъчна суспензия с гъстота 1,6.10 6 кл./ml (за миеломни клетки) или 0,4.10 6 клетки/ml (за клетки SAOS-2). Получената суспензия се разпределя по 500 μl на ямка, в толкова ямки, колкото са необходими за целите на конкретния експеримент. 2. Плаката се поставя в инкубатор при 37°С, 5% CO2 и максимална влажност, за вре- мето докато се приготви разтворът за трансфекция (при трансфекция на миеломни кле- тки) или за 24 часа (при трансфекция на клетки SAOS-2). 3. Изчислява се необходимото количество от флуоресциращия олигонуклеотид съ- образно броя на ямките, които трябва да бъдат трансфектирани с него. Крайната му концентрация трябва да е 100 nM, което означава, че са необходими 60 pmol на ямка – количество, което се съдържа в 3 µl от изходния разтвор на олигонуклеотида. Необхо- димото количество плазмидна ДНК се изчислява по сходен начин, като се предвиждат по 0,8 µg на ямка. 4. Изчислява се необходимото количество Lipofectamine 2000, като се предвиждат по 2 μl за ямка. Когато се провежда трансфекция с цел след това да се изследва прежи- вяемостта на клетките, трансфектирани с даден плазмид, се предвиждат и контроли, третирани само с Lipofectamine 2000. Пресметнатото количество винаги се завишава с 5%, за да има резерв. 5. Изчислените обеми от всеки разтвор на плазмид или олигонуклеотид се отпипети- рат в отделни епруветки. Всяка епруветка се допълва със среда OPTI-MEM® I до обем, който се изчислява по формулата 50 μl × брой на ямките, в които ще се проведе транс- фекция със съответния олигонуклеотид или плазмид. Сместа се разбърква чрез бавно и внимателно пипетиране нагоре-надолу. 6. Изчисленото количество Lipofectamine 2000 се отпипетира в епруветка. Разреж- да се с 24 пъти по-голям обем среда OPTI-MEM® I. Пипетира се бавно и внимателно. 7. Изчакват се 5 минути. 8. Във всяка епруветка, съдържаща разтвор на олигонуклеотид или плазмид, се от- пипетира еквивалентен обем от получения разтвор на Lipofectamine 2000. Сместа се разбърква чрез бавно и внимателно пипетиране нагоре-надолу. 9. Изчакват се 20 минути, за да се образуват липоплекси (комплекси от липозоми и нуклеинови киселини).
Page 1:
МЕДИЦИНСКИ УНИВЕРС
Page 4 and 5:
Сравнително in vitro и
Page 6 and 7:
Page 8 and 9:
Page 10 and 11:
Page 13 and 14:
Увод Мултипленият
Page 15 and 16:
15 I. Литературен обз
Page 17 and 18:
Page 19 and 20:
VEGF и bFGF TNFα IL-6 СКМК TN
Page 21 and 22:
Page 23 and 24:
Page 25 and 26:
Page 27 and 28:
Page 29 and 30:
Page 31 and 32:
Page 33 and 34:
Page 35 and 36:
Page 37 and 38:
Page 39 and 40:
Page 41 and 42:
Page 43 and 44:
1.6.7. Инхибитори на Hs
Page 45 and 46:
Page 47 and 48:
1.7. Заключение 47 I. Л
Page 49 and 50:
Page 51 and 52:
Page 53 and 54:
Page 55 and 56:
Page 57 and 58:
Page 59 and 60:
2.5.7. Непреки механи
Page 61 and 62:
Page 63 and 64:
Page 65 and 66:
3. Куркумин 3.1. Добив
Page 67 and 68:
3.3.1. Пряко взаимоде
Page 69 and 70:
Page 71 and 72:
Page 73 and 74:
Page 75 and 76:
Page 77 and 78:
Page 79 and 80:
Page 81 and 82:
Page 83 and 84:
Page 85 and 86:
II. ЦЕЛ И ЗАДАЧИ 1. Це
Page 87 and 88:
III. МАТЕРИАЛИ И МЕТО
Page 89 and 90:
89 III. Материали и ме
Page 91 and 92:
Page 93 and 94:
Page 95 and 96: 95 III. Материали и ме
Page 97 and 98: среда, предварител
Page 107 and 108: хранителна среда. 10
Page 113 and 114: до 6. 113 III. Материали
Page 115 and 116: броя на пробите. 4. Т
Page 129 and 130: ресуспендирани ядр
Page 145: 2.16.2. Пречистване на
Page 153 and 154: IV. РЕЗУЛТАТИ 1. Клет
Page 155 and 156: IV. Резултати - Клетъ
Page 197 and 198:
IV. Резултати - Механ
Page 199 and 200:
Page 201 and 202:
Page 203 and 204:
А IV. Резултати - Мех
Page 205 and 206:
Page 207 and 208:
Erufosine, µM: А Erufosine, µM:
Page 209 and 210:
А Б IV. Резултати - Ме
Page 211 and 212:
Page 213 and 214:
Page 215 and 216:
Page 217 and 218:
Page 219 and 220:
Page 221 and 222:
OPM-2 Относително нив
Page 223 and 224:
RPMI-8226 Относително н
Page 225 and 226:
Page 227 and 228:
Page 229 and 230:
60 50 40 30 20 10 IV. Резулт
Page 231 and 232:
3. Влияние на различ
Page 233 and 234:
IV. Резултати - Влиян
Page 235 and 236:
Page 237 and 238:
Page 239 and 240:
Page 241 and 242:
Page 243 and 244:
Page 245 and 246:
Page 247 and 248:
Фиг. IV.73. Влияние на
Page 249 and 250:
Фиг. IV.74. Влияние на
Page 251 and 252:
Page 253 and 254:
Page 255 and 256:
Page 257 and 258:
тромбин: IV. Резулта
Page 259 and 260:
Page 261 and 262:
Б IV. Резултати - Вли
Page 263 and 264:
Page 265 and 266:
Page 267 and 268:
Page 269 and 270:
Мигрирали клетки, %
Page 271 and 272:
Page 273 and 274:
Page 275 and 276:
% на преживелите кл
Page 277 and 278:
Page 279 and 280:
U-266 - + - + - - 20 20 IV. Рез
Page 281 and 282:
Page 283 and 284:
Гъстота на клеткит
Page 285 and 286:
V. ОБСЪЖДАНЕ НА РЕЗУ
Page 287 and 288:
287 V. Обсъждане на ре
Page 289 and 290:
Page 291 and 292:
Page 293 and 294:
Page 295 and 296:
Page 297 and 298:
Page 299 and 300:
Page 301 and 302:
Page 303 and 304:
Page 305 and 306:
Page 307 and 308:
Page 309 and 310:
309 VI. Изводи 6. Еруфо
Page 311 and 312:
VII. БИБЛИОГРАФИЯ 1. Ab
Page 313 and 314:
313 VII. Библиография 3
Page 315 and 316:
Page 317 and 318:
Page 319 and 320:
Page 321 and 322:
Page 323 and 324:
Page 325 and 326:
Page 327 and 328:
076) Стерилни епруве
Page 329 and 330:
2.3. За оценка на адх
Page 331 and 332:
331 VIII. Приложение I
Page 333 and 334:
1 M MOPS; 1 M Трис; 2% SDS; 20
Page 335 and 336:
335 VIII. Приложение I Ak
Page 337 and 338:
337 VIII. Приложение I Go
Page 339 and 340:
339 VIII. Приложение I 6.
Page 341 and 342:
pH на буфера трябва
Page 343 and 344:
- 5`-праймер: 5` - ЦГЦ А
Page 345 and 346:
345 VIII. Приложение I T
Page 347 and 348:
10× TBE-буфер, приготв
show all

PhD Thesis_ver3.pdf

Create successful ePaper yourself

Delete template?

Save as template?