PhD Thesis_ver3.pdf

Сравнително in vitro изследване на нови възможности за фармакологично повлияване на
мултипления миелом
FBS, а преди експериментите клетките бяха държани в безсерумна среда, за да се пре-
дизвика у тях глад за факторите, съдържащи се в серума. Измерването на относителния
брой на мигриралите клетки беше осъществявано чрез оцветяването им със CellTiter
Blue® (разтвор, съдържащ тъмносиньото багрило ресазурин, което в метаболитно акти-
вните клетки се превръща в розов резоруфин) и последващо флуорометрично отчитане
на резултата. Методът има много нисък праг на чувствителност – около 200 клетки/ям-
ка. Експериментите бяха провеждани съгласно следния протокол:
1. От всяка подлежаща на изследване клетъчна култура, след определяне на гъстота-
та ѝ , се взима обем, съдържащ 4.10 6 клетки и се прехвърля в центрофужна епруветка.
Епруветките се центрофугират 5 минути при 1 500 об./мин.
2. Надстоящата течност се изхвърля, а утайките от клетки се ресуспендират в по 4 ml
безсерумна среда OPTI-MEM® I и се прехвърлят в отделни ямки на 24-ямкова плака,
по 2 ml/ямка.
духа.
3. Плаката се поставя в инкубатор при 37 C, 5% CO2 и максимална влажност на въз-
4. (Важи в случаите, когато се изследва влиянието на Erufosine.) Деветнадесет часа
по-късно, в едната от двете ямки за всеки вид клетки се добавя разтвор на еруфозин до
постигане на желаната концентрация. Другите ямки остават за нетретирани контроли.
Плаката се връща в инкубатора за още 5 часа.
5. На 24-ия час се взима нова стерилна 24-ямкова плака и в нея се разпределят по 600
µl среда OPTI-MEM® I на ямка. Броят на нужните ямки се определя като броят на про-
бите се умножи по 3 или 4 (защото от всяка проба се правят по 3 или 4 повторения на
миграционния тест) и се добави още една, която да служи като празна проба. Същият
брой ямки се запълват с по 600 µl среда OPTI-MEM® I, обогатена с FBS до 10% крайна
концентрация.
6. Във всяка ямка (но не и в двете предназначени за празни проби) се поставя внима-
телно по един стерилен поликарбонатен филтър Millicell®-PCF с диаметър на порите 8
µm така, че долната му част с мембраната да е потопена изцяло в хранителната среда.
7. Плаката с клетките се изважда от инкубатора. От съдържанието на всяка ямка,
чрез добавяне на OPTI-MEM® I, се приготвя разредена клетъчна суспензия с гъстота
0,5.10 6 кл./ml (ако клетките са U-266 или OPM-2) или 0,25.10 6 кл./ml (ако клетките са
RPMI-8226).
8. От всяка отделна разредена клетъчна суспензия, приготвена в стъпка 7., се прех-
върлят по 400 µl/филтър в пространството над мембраната на 3 или 4 филтъра, потопе-
108