PhD Thesis_ver3.pdf

Сравнително in vitro изследване на нови възможности за фармакологично повлияване на
мултипления миелом
10. Във всяка ямка с клетки, предопределени за трансфектиране, се отпипетират по
100 μl от съответния липоплексен разтвор.
11. В контролните ямки се отпипетират по 100 μl среда OPTI-MEM® I. Когато се
провежда трансфекция с цел след това да се изследва преживяемостта на клетките, в
ямките, служещи за контрола на собствената токсичност на трансфектиращия реагент,
се отпипетират по 50 µl от разредения Lipofectamine 2000 и 50 µl среда OPTI-MEM®
I.
12. Плаката се разклаща внимателно в хоризонтално направление и се връща в инку-
батора.
13. След 6 до 24 часа, от клетките, трансфектирани с флуоресциращ олигонуклеотид,
се приготвят микроскопски препарати за оценка на трансфекционната ефективност, ка-
кто е описано в т. 2.9. Към останалите клетки се добавя прясна хранителна среда, за да
се поддържат в експоненциална фаза на растеж.
14. При задоволително ниво на трансфекция, от клетките могат периодично (напр. на
24-ия, 48-ия и 72-ия час от трансфекцията) да се взимат проби за имуноблот, RT-PCR
или оценяване на преживяемостта, така както е описано в съответните протоколи.
2.17.2. Трансфекция с помощта на TurboFect
1. Приготвя се суспензия от миеломни клетки с гъстота 0,5.10 6 кл./ml и се разпределя
в стерилна 24-ямкова плака по 1 ml на ямка.
ност.
2. Плаката се оставя за 24 часа в инкубатор при 37°С, 5% CO2 и максимална влаж-
3. Изчислява се необходимото количество от флуоресциращия олигонуклеотид съ-
образно броя на ямките, които трябва да бъдат трансфектирани с него. Крайната му
концентрация трябва да е 100 nM, което означава, че са необходими 110 pmol на ямка –
количество, което се съдържа в 5,5 µl от изходния разтвор на олигонуклеотида.
4. Изчисленият обем от разтвора на флуоресциращия олигонуклеотид се отпипетира
в епруветка. Допълва се със среда OPTI-MEM® I до обем, който се изчислява по фор-
мулата 100 μl × брой на ямките, подлежащи на трансфекция. Сместа се разбърква чрез
бавно и внимателно пипетиране нагоре-надолу.
5. Флаконът с TurboFect се „вортексира” кратко. Към разтвора на олигонуклеотида
се добавя 50 пъти по-малък обем TurboFect. Разбърква се незабавно чрез пипетиране
или „вортексиране”.
148