PhD Thesis_ver3.pdf

123
III. Материали и методи – Методи
2. Мембраните се поставят за кратко с опаковата си страна върху попивателна хар-
тия, за да се отстрани излишното количество хемилуминесцентен реактив.
3. Мембраните се опаковат в полипропиленово фолио и се поставят в рентгенови ка-
сети, като се закрепват стабилно с помощта на лепенки.
4. В тъмна стая, върху мембраните се поставя фотографски филм и касетите се зат-
варят плътно.
5. Изчаква се известно време (от 2 секунди до 1 час в зависимост от видимия интен-
зитет на луминесценцията), касетата се отваря и филмът се проявява. Ако се окаже, че
филмът е преекспониран или недостатъчно експониран, се прави втора снимка, като
времето на експозиция съответно се намалява или увеличава.
6. Филмите се сканират и се архивират в електронен вид. Интензитетите на отделни-
те бандове и съответно относителните нива на протеините в пробите се определят ден-
ситометрично чрез програмата Quantity One. За всяка проба се изчисляват съотношени-
ята между денситометрично определените интензитети на бандовете на търсените про-
теини и съответния интензитет за контролния протеин за групата от проби (най-често
β-актин). В повечето случаи е практично тези съотношения в една от пробите (контрол-
ната) да се приемат за единици и останалите да се приравнят спрямо тях. Така се вижда
колко пъти по-високи или по-ниски са нивата на търсените протеини в пробите в
сравнение с контролата.
2.7.10. Отстраняване на антителата от мембраните (стрипиране)
Стрипиране на мембраните се прави, когато се иска мембрана, маркирана с антитяло
срещу един протеин, да се използва за определяне на друг протеин със съответно друго
антитяло.
1. Приготвя се стрипиращ разтвор, както е описано в т. 4.9. на приложение I. Разпре-
деля се по 25 ml в 50-милилитрови епруветки, според броя на мембраните. Разтворът се
загрява до 56 C.
2. Във всяка епруветка се поставя по една мембрана. Лицевата страна на мембраната