PhD Thesis_ver3.pdf

среда, предварително затоплена до 37°C.
97
III. Материали и методи – Методи
4. В малък матрак (25 cm 2 ) се отпипетират 4 ml среда, предварително затоплена до
37°C, след което се добавя клетъчната суспензия и сместа се хомогенизира. Ако кле-
тъчната линия е OPM-2, се добавят и 555 µl FBS, така че крайната концентрация на FBS
да е 20%.
5. Матракът се поставя в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и максимална влажност на
въздуха.
6. През следващата една седмица към клетките се добавя по малко прясна хранител-
на среда, като се внимава суспензионните клетки да не се разредят повече от допусти-
мото (0,3-0,4.10 6 кл./ml). Към клетки OPM-2 се добавя и FBS, така че концентрацията
му в средата да се поддържа на 20%.
2.1.3. Поддържане на клетките в експоненциална фаза на растеж
Протоколът е различен в зависимост от това дали се касае за адхерентни клетки, ка-
квито са SAOS-2, или за суспензионни, каквито са останалите използвани клетъчни
линии.
Суспензионни клетки:
1. На всеки два дни от матраците се отстраняват 1/2 до 2/3 от обема на клетъчната
суспензия и се прибавя хранителна среда, в количество равно на отстраненото. Когато
част от клетките са залепнали за дъното на матрака (характерно за U-266 и RPMI-8226)
те трябва първо да се отлепят чрез остъргване с подходящ за целта инструмент. Внима-
ва се клетките да не се разредят повече от допустимото (0,3-0,4.10 6 кл./ml).
2. Отстранената клетъчна суспензия може да се изхвърли, да се използва за заселване
на нов матрак или да се подготви за замразяване (т. 2.1.4.). Във втория случай, след
прехвърлянето ѝ в нов матрак, към нея се добавя толкова хранителна среда, така че
гъстотата на клетките да е около 0,3-0,4.10 6 кл./ml.
3. Ако клетъчната суспензия е станала жълта на цвят, е необходима цялостна подмя-
на на средата, което се постига чрез центрофугиране (5 мин при 1 500 об./мин) и пос-
ледващо ресуспендиране на утайката от клетки в прясна хранителна среда.
Адхерентни клетки (SAOS-2):
1. При достигане на висока степен на конфлуентност на клетките (над 90%), старата
среда се изсмуква.
2. Монослоят от клетки се промива с 5-10 ml стерилен фосфатен буфер (PBS).