PhD Thesis_ver3.pdf

2. Методи
2.1. Култивиране на туморни клетки
Отглеждането на клетъчни култури изисква спазване на асептични условия на рабо-
та, за да не се допусне замърсяване с други организми като бактерии или дрожди. Зато-
ва всички манипулации с клетките, както и с материалите влизащи в пряк досег с тях,
бяха извършвани при асептични условия в ламинарен бокс, осигуряващ постоянен по-
ток на стерилен въздух чрез система от филтри. Материалите и разтворите, които бяха
приготвяни от нас и позволяваха това, бяха автоклавирани предварително при 121ºC в
продължение на 30 мин. Всички предмети бяха дезинфекцирани със 70%-ен етанол
преди внасяне в ламинарния бокс.
Култивирането на клетките беше провеждано съгласно следните протоколи:
2.1.1. Приготвяне на хранителна среда
1. Към 500 ml среда RPMI-1640 се добавят 56,2 ml топлинно инактивиран фетален
телешки серум (56°C за 30 минути) и 5,62 ml разтвор на L-глутамин (200 mM).
2. 5 ml от така приготвената среда се поставят в матрак, който се оставя в инкубатор
при 37°C, 5% CO2 и максимална влажност на въздуха.
3. Бутилката с готовата среда се съхранява в хладилник при 4°C.
4. На следващия ден матракът се проверява за наличие на микробен растеж. Ако ня-
ма такъв, средата може да се използва за култивиране на клетки. 15 минути преди упот-
реба бутилката се изважда от хладилника и се поставя във водна баня при 37°C.
2.1.2. Размразяване на криоконсервирани клетки
1. Взима се епруветка със замразени клетки (съхранявани при –80°C или –150°C) и
се поставя при 37°C до размразяване на клетъчната суспензия.
2. Клетъчната суспензия се прехвърля в центрофужна епруветка и се центрофугира 5
минути при 1 500 об./мин.
3. Надстоящата течност се изсмуква, а утайката се ресуспендира в 1 ml хранителна
96