PhD Thesis_ver3.pdf

99
III. Материали и методи – Методи
9. На следващия ден епруветките със замразените клетки се изваждат от кутията и се
прехвърлят във фризер, поддържащ –150°С.
2.1.5. Култивиране в обща среда на физически разделени едни от други
миеломни клетки U-266 и остеобластни SAOS-2
1. Приготвя се суспензия от клетки SAOS-2 с гъстота 1.10 6 кл./ml. Тя се разпределя
по 0,5 ml в 6 ямки на 24-ямкова плака.
духа.
2. Плаката се поставя в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и максимална влажност на въз-
3. След прилепване на клетките към дъното, в три от ямките внимателно се поставя
по един стерилен поликарбонатен филтър Millicell®-PCF с диаметър на порите 0,4 µm
така, че долната му част с мембраната да е потопена изцяло в течната среда.
4. Приготвя се суспензия от клетки U-266 с гъстота 1.10 6 кл./ml. От нея се прехвър-
лят по 500 µl в пространството над мембраната на всеки филтър, както и по 1 ml в 2 или
3 празни ямки.
5. Плаката се връша в инкубатора.
6. Четиридесет и осем часа по-късно култивирането приключва и се взимат отделни
проби за имуноблот (т. 2.7.1.) от двата вида клетки, както от ямките за съвместно кул-
тивиране, така и от контролните ямки за самостоятелно култивиране.
2.1.6. Триизмерно клетъчно култивиране във въртящи се биореактори
1. Eдин биореакторен модул Synthecon® се запълва със суспензия от клетки SAOS-2
в хранителна среда. Нужни са около 10-11 ml с гъстота 0,3.10 6 кл./ml.
2. Биореакторният модул се прикрепва към въртящото устройство и заедно с него се
поставя в инкубатор при 37°C, 5% CO2 и максимална влажност на въздуха. Пуска се да
се върти на бавни обороти.
3. След 24 часа започва да се наблюдава формиране на малки сфероиди от клетки
SAOS-2. В хода на времето те нарастват на големина, стават по-тежки и започват да па-
дат в периферията на съда. В такъв случай скоростта на въртене се усилва, така че сфе-
роидите да се намират в състояние на относителна безтегловност и да запазват траекто-
рия, близка до центъра на биореакторния модул.